Please use this identifier to cite or link to this item:
https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/39916Full metadata record
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.author | Τσαπάρα, Αικατερίνη | el |
| dc.date.accessioned | 2026-03-23T10:28:34Z | - |
| dc.date.available | 2026-03-23T10:28:34Z | - |
| dc.identifier.uri | https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/39916 | - |
| dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States | * |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/us/ | * |
| dc.subject | Α-συνουκλεϊνη | el |
| dc.subject | Τρεχαλόζη | el |
| dc.subject | Ζυμομύκητας | el |
| dc.title | Διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων της α-συνουκλεΐνης με τις πρωτεΐνες του Saccharomyces cerevisiae και της παραγωγής τρεχαλόζης ως απόκριση στην τοξικότητα | el |
| dc.type | masterThesis | en |
| heal.type | masterThesis | el |
| heal.type.en | Master thesis | en |
| heal.type.el | Μεταπτυχιακή εργασία | el |
| heal.dateAvailable | 2026-03-23T10:29:34Z | - |
| heal.language | el | el |
| heal.access | free | el |
| heal.recordProvider | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας | el |
| heal.publicationDate | 2026-02-26 | - |
| heal.abstract | Η α-συνουκλεΐνη εκφράζεται άφθονα στο προσυναπτικό άκρο των νευρώνων των σπονδυλωτών (συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου) και κωδικοποιείται από το γονίδιο SNCA. Σε παθολογικές καταστάσεις, μετατρέπεται από διαμόρφωση αέλικας σε β-πτυχωτή επιφάνεια και σχηματίζει κυτταροπλασματικά έγκλειστα (Lewy Bodies) με τοξικές συνέπειες για τα κύτταρα καθώς αποτελούν αιτία νευροεκφυλιστικών ασθενειών με κυριότερη την νόσο του Parkinson. Ο Saccharomyces cerevisiae αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για τη μοντελοποίηση των νευροεκφυλιστικών διαταραχών, εφόσον πολλές βασικές κυτταρικές διαδικασίες παραμένουν ισχυρά διατηρημένες μεταξύ αυτού και των ανθρώπινων νευρικών κυττάρων, όπως η αναδίπλωση των πρωτεϊνών και η κυκλοφορία μέσω των μεμβρανών του συστήματος Golgi και του ενδοπλασματικού δικτύου. Σε προηγούμενες εργασίες έχουν κλωνοποιηθεί γονίδια ορισμένων μορφών της ασυνουκλεΐνης σε στελέχη ζυμομυκήτων. Μεταξύ άλλων έχει μελετηθεί η επαγωγή μεταβολικών μονοπατιών της βιοσύνθεσης της τρεχαλόζης ως απόκριση στην τοξικότητα που προκαλείται, καθώς και μια πρώτη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων της α-συνουκλεΐνης με τις πρωτεΐνες του ζυμομύκητα η οποία κατέδειξε κυρίως την αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH). Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της αλληλεπίδρασης της ασυνουκλεΐνης με την GAPDH του Saccharomyces cerevisiae στην φάση της γήρανσης των κυττάρων καθώς και ο προσδιορισμός της παραγόμενης τρεχαλόζης με ενζυμική μέθοδο σε συγκεκριμένες φάσεις ανάπτυξης κυττάρων του ζυμομύκητα που εκφράζουν την α-συνουκλεΐνη αγρίου τύπου και την μεταλλαγμένη μορφή της Α53Τ. Για την μελέτη των αλληλεπιδράσεων, υπερεφκράστηκε, απομονώθηκε και καθαρίστηκε και τακτοποιήθηκε με ανοσοαποτύπωση Western ανασυνδυασμένη ασυνουκλεΐνη με ουρά 6 ιστιδινών στο καρβοξυτελικό άκρο της. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη δόλωμα σε πειράματα αλληλεπίδρασης συγκατακρίμνηση (pull down assay) με ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα του ζυμομύκητα αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα TPS1Δ με έλλειψη της συνθάσης της τρεχαλόζης από την στατική φάση ανάπτυξης καθώς στη φάση αυτή εκδηλώνεται ο παθολογικός φαινότυπος της α-συνουκλεΐνης. Ως αποτέλεσμα της συγκατακρίμνησης, παρατηρήθηκε μια ζώνη στα 19kDa που θεωρείται ότι αντιστοιχεί στην α-συνουκλεΐνη, μια στα 45 kDa καθώς και μια ασθενέστερη στα 35kDa. Η ζώνη των 45 kDa συνεπικουρούμενη από τις άλλες δύο αποτέλεσε το αντικείμενο της περεταίρω διερεύνησης ώστε να διαπιστωθεί, αν πρόκειται για αλληλεπίδραση της α-συνουκλεΐνης με άλλη πρωτεΐνη μεγαλύτερου μοριακού βάρους. Η ανοσοδοκιμασία Western που ακολούθησε δεν κατέδειξε αλληλεπίδραση για κανένα από τα δύο στελέχη του ζυμομύκητα, ούτε με αντίσωμα έναντι της ασυνουκλεΐνης αλλά ούτε και με αντίσωμα έναντι της GAPDH, παρόλη την επανειλημμένη πραγματοποίηση των πειραμάτων με ταυτόχρονη βελτίωση των συνθηκών. Αυτό θεωρείται ότι οφείλεται σε τεχνικά προβλήματα τα οποία πρέπει να επιλυθούν, ώστε να επιβεβαιωθεί η αλληλεπίδραση των δυο πρωτεϊνών και να κατανοηθεί ο ρόλος της και οι συνέπειες που ενδέχεται να έχει στα κύτταρα του ζυμομύκητα. Στο δεύτερο σκέλος της παρούσας εργασίας χρησιμοποιήθηκε ενζυμική μέθοδος με τρεχαλάση για τον ποσοτικό προσδιορισμό τρεχαλόζης σε κύτταρα του Saccharomyces cerevisiae στις 4 χαρακτηριστικές φάσεις ανάπτυξης του ζυμομύκητα. Για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα χωρίς α-συνουκλεΐνη, κύτταρα με α-συνουκλεΐνη αγρίου τύπου και κύτταρα με μεταλλαγμένη Α53Τ συνουκλεΐνη. Στόχος ήταν να διαπιστωθεί πως επηρεάζεται η παραγωγή τρεχαλόζης σε κάθε στέλεχος με την εκάστοτε μορφή α-συνουκλεΐνης. Από τα πειράματα διαπιστώθηκε πως απουσία α-συνουκλεΐνης η τρεχαλόζη παράγεται κυρίως κατά την στατική φάση ανάπτυξης, γεγονός αναμενόμενο καθώς πρόκειται για φάση ανάπτυξης όπου υπάρχει έλλειψη θρεπτικών συστατικών και τοξικά φαινόμενα για τα κύτταρα με αποτέλεσμα την καταπόνησή τους. Στα κύτταρα με την α-συνουκλεΐνη αγρίου τύπου, η τρεχαλόζη παράγεται νωρίτερα, κορυφώνεται στην μεταδιαυξική φάση και διατηρείται μέχρι την στατική. Αυτό δείχνει πως η παρουσία α-συνουκλεΐνης ωθεί τα κύτταρα στην παραγωγή τρεχαλόζης νωρίτερα στην ανάπτυξη. Τέλος, κύτταρα με μεταλλαγμένη Α53Τ συνουκλεΐνη παράγουν τρεχαλόζη στην μεταδιαυξική φάση ανάπτυξης και η παραγωγή της κορυφώνεται στην στατική φάση. Πρόκειται για την πιο τοξική μορφή α-συνουκλεΐνης επομένως είναι αναμενόμενο η τρεχαλόζη να παράγεται νωρίς στην ανάπτυξη. | el |
| heal.abstract | A-synuclein is abundantly expressed in the presynaptic terminal of vertebrate neurons (including humans) and is encoded by the SNCA gene. In pathological conditions, it forms cytoplasmic inclusions (Lewy Bodies) with toxic consequences for cells as they are the cause of neurodegenerative diseases, the most important being Parkinson's disease. Saccharomyces cerevisiae is an important tool for modeling neurodegenerative disorders, as many fundamental cellular processes remain highly conserved between it and human neuronal cells, such as protein folding and trafficking through the membranes of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum. In previous studies, genes encoding certain forms of a-synuclein have been cloned into yeasts strains. Among other findings, the induction of metabolic pathways involved in trehalose biosynthesis has been investigated as a response to the induced toxicity, as well as an initial exploration of the interactions between a-synuclein and yeast proteins, which primarily identified glyceldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). The aim of the present study was to investigate the interaction between a-synuclein and GAPDH of Saccharomyces cerevisiae during the aging phase, as well as to determine the produced trehalose using an enzymatic method at characteristic growth phases of yeast cells expressing wild-type a-synuclein and its mutant form A53T. To study protein interactions, recombinant α-synuclein with a 6-histidine tail at its carboxy terminus was overexpressed, isolated, purified and identified by Western immunoblotting. Subsequently, it was used as a bait protein in interaction experiments with total protein extracts from wild-type yeast cells and TPS1Δ mutant cells lacking trehalose synthase, collected during the stationary phase of growth, since the pathological phenotype of a-synuclein is manifested during this phase. As a result of pull down assay, a band at 19kDa, believed to correspond to a-synuclein, was observed, along with one at 45 kDa and a weaker-intensity band at 35kDa. The 45 kDa band, together with the other two, became the focus of further investigation to determine whether it represents an interaction of a-synuclein with another protein of higher molecular weight. The subsequent Western immunoblotting did not demonstrate any interaction for either yeast strain, neither with an antibody against α-synuclein nor with an antibody against GAPDH, despite repeated experiments with simultaneous improvement of the conditions. This is thought to be due to technical problems that need to be resolved in order to confirm the interaction between the two proteins and to understand its role and the consequences it may have on yeast cells. 7 In the second part of this work, an enzymatic method with trehalase was used for the quantitative determination of trehalose in Saccharomyces cerevisiae cells in the 4 characteristic growth phases of the yeast. Cells lacking α-synuclein, cells with wildtype α-synuclein, and cells with mutant A53T synuclein were used for the experiments. The aim was to determine how trehalose production is affected in each strain with each form of α-synuclein. The experiments found that in the absence of α-synuclein, trehalose is produced mainly during the static growth phase, which is expected since this is a growth phase where there is lack of nutrients and toxic effects on the cells, resulting in their exhaustion. In cells with wild-type α-synuclein, trehalose is produced earlier, peaks in the post-diauxic phase, and is maintained until the stationary phase. This indicates that the presence of α-synuclein prompts cells to produce trehalose earlier in development. Finally, cells expressing the A53T mutant form of a-synuclein produce trehalose during the post-diauxic phase, and its production peaks in the stationary phase. Since this is the most toxic form of a-synuclein, it is therefore expected that trehalose production is induced early during growth. | en |
| heal.advisorName | Αφένδρα, Αμαλία-Σοφία | el |
| heal.committeeMemberName | Αφένδρα, Αμαλία-Σοφία | el |
| heal.committeeMemberName | Φριλίγγος, Ευστάθιος | el |
| heal.committeeMemberName | Λιακόπουλος, Δημήτριος | el |
| heal.committeeMemberName | Δουρής, Βασίλειος | el |
| heal.committeeMemberName | Μιχαηλίδης, Θεολόγος | el |
| heal.academicPublisher | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής | el |
| heal.academicPublisherID | uoi | el |
| heal.numberOfPages | 84 | el |
| heal.fullTextAvailability | true | - |
| Appears in Collections: | Διατριβές Μεταπτυχιακής Έρευνας (Masters) - ΙΑΤ | |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| master διορθωμένο.pdf | 3.4 MB | Adobe PDF | View/Open |
This item is licensed under a Creative Commons License
