Please use this identifier to cite or link to this item:
https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/29321Full metadata record
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.author | Τσαλαγράδας, Πέτρος | el |
| dc.date.accessioned | 2019-03-15T08:11:41Z | - |
| dc.date.available | 2019-03-15T08:11:41Z | - |
| dc.identifier.uri | https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/29321 | - |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.26268/heal.uoi.3090 | - |
| dc.rights | Default License | - |
| dc.subject | Ενδοκυττάρωση | el |
| dc.subject | Κύτταρα | el |
| dc.title | Μελέτη της αλληλεπίδρσης μεταξύ της κυτταροπλασματικής ακετοακετυλο CoA θειολάσης (ACAT2) και της RAB5 | el |
| heal.type | masterThesis | - |
| heal.type.en | Master thesis | en |
| heal.type.el | Μεταπτυχιακή εργασία | el |
| heal.classification | Κύτταρα | el |
| heal.dateAvailable | 2019-03-15T08:12:41Z | - |
| heal.language | el | - |
| heal.access | free | - |
| heal.recordProvider | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής | el |
| heal.publicationDate | 2018 | - |
| heal.bibliographicCitation | Βιβλιογραφία: σ. 89-94 | el |
| heal.abstract | Η ενδοκυττάρωση αποτελεί μία βασική κυτταρική διεργασία η οποία επιτρέπει στα κύτταρα όχι μόνο να προσλαμβάνουν θρεπτικά συστατικά από το εξωτερικό περιβάλλον, αλλά και να μεταβάλλουν την σύσταση της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και των ενδοκυττάριων οργανιδίων, ελέγχοντας έτσι καίριες κυτταρικές λειτουργίες, όπως η κυτταρική αύξηση, διαφοροποίηση και απόπτωση. Τα πρώιμα στάδια της ενδοκυττάρωσης θεωρούνται κρίσιμα, καθώς παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετέπειτα πορεία του ενδοκυτταρωμένου φορτίου, καθορίζοντας έτσι τη «μοίρα» του. Στα πρώιμα στάδια της ενδοκυττάρωσης συμμετέχουν τα πρώιμα ενδοσώματα, όπου πραγματοποιείται η διαλογή του φορτίου. Σε αυτή τη διαδικασία συμμετέχουν πλειάδα πρωτεϊνικών μορίων, ανάμεσα στα οποία κυρίαρχο ρόλο κατέχει η μικρή ΘΤΡάση Rab5. Οι λειτουργίες της Rab5 καθορίζονται από τον νουκλεοτιδικό της κύκλο καθώς και από την αλληλεπίδρασή της με ένα ευρύ δίκτυο πρωτεϊνών-τελεστών, που περιλαμβάνει πάνω από 30 πρωτεΐνες. Στην προσπάθεια κατανόησης των μηχανισμών της ενδοκυττάρωσης, σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου ανιχνεύθηκε με φασματοφωτομετρία μάζας μία άγνωστη μέχρι σήμερα αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Rab5: H αλληλεπίδρασή της με την κυτταροπλασματική ακετοακετυλο-ΟοΛ θειολάση. Η πρωτεΐνη αυτή είναι ένα ένζυμο του μεταβολισμού των λιπιδίων, και πιο συγκεκριμένα, το πρώτο ένζυμο του μονοπατιού σύνθεσης του μεβαλονικού οξέος στην οδό βιοσύνθεσης της χοληστερόλης. Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι η κυτταροπλασματική ακετοακετυλο-ΟοΛ θειολάση έχει επίσης δράση πρωτεϊνικής ακετυλο-τρανσφεράσης, καθιστώντας την έτσι ένα υποψήφιο ρυθμιστή της δράσης πρωτεϊνικών μορίων. Το γεγονός ότι ένα ένζυμο του μεταβολισμού φαίνεται να αλληλεπιδρά με μία καίρια πρωτεΐνη των πρώιμων γεγονότων της ενδοκυττάρωσης (Rab5), οδηγεί σε σημαντικά ερωτήματα τόσο σχετικά με την εξειδίκευση και τα βιοφυσικά δεδομένα αυτής της αλληλεπίδρασης, όσο και για τη σημασία της στις κυτταρικές λειτουργίες. Στην παρούσα διπλωματική εργασία διερευνήθηκε η απευθείας αλληλεπίδραση της Rab5 με την κυτταροπλασματική ακετοακετυλο-ΟοΛ θειολάση, χρησιμοποιώντας καθαρές πρωτεΐνες εκφρασμένες σε βακτήρια. Σε πρώτη φάση, οι δύο πρωτεΐνες υπερεκφράστηκαν συζευγμένες με το πρόσδεμα GST σε κατάλληλο βακτηριακό στέλεχος και ακολούθησε ο καθαρισμός τους. Στη συνέχεια, αφαιρέθηκε το πρόσδεμα GST με ενζυμική πρωτεόλυση, για την παραγωγή καθαρής κυτταροπλασματικής ακετοακετυλο-CoA θειολάσης, ενώ στην Rab5 διατηρήθηκε το πρόσδεμα της GST. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε επώαση των δύο πρωτεϊνών και συγκατακρήμνισή τους με σφαιρίδια γλουταθειόνης. Ακολούθησαν πλύσεις της στήλης για την απομάκρυνση της αδέσμευτης κυτταροπλασματικής ακετοακετυλο-CoA θειολάσης και, έπειτα, πραγματοποιήθηκε ειδική έκλουση του προσδεμένου ενζύμου με διάλυμα που περιείχε EDTA, το οποίο αφαιρώντας το Mg2+/GDP τροποποιεί την διαμόρφωση της Rab5 και οδηγεί σε εξειδικευμένη έκλουση των δεσμευμένων πρωτεϊνών. Τα εκλουσμένα δείγματα αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμίδης SDS-PAGE 12% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωση κατά Western με τη χρήση εξειδικευμένων πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι της κυτταροπλασματικής ακετοακετυλο-CoA θειολάσης. Η μεθοδολογία αυτή ανέδειξε ότι οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν ακόμη και σε πλήρως καθαρισμένη μορφή, παρόλο που και οι δύο πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν σε εταιρόλογο βακτηριακό σύστημα, αποδεικνύοντας έτσι ότι η αλληλεπίδρασή τους είναι άμεση και δεν απαιτεί άλλη ενδιάμεση πρωτεΐνη. Παρατηρήθηκε ότι η κυτταροπλασματική ακετοακετυλο-CoA θειολάση αλληλεπιδρά με την GST-Rab5a:GDP με δοσοεξαρτώμενη σχέση. Ακόμη, αποδείχθηκε ότι η κυτταροπλασματική ακετοακετυλο-CoA θειολάση αλληλεπιδρά με την GDP (ανενεργή) μορφή της Rab5. Τέλος, έγινε μία προσπάθεια προσδιορισμού των φυσικοχημικών και θερμοδυναμικών ιδιοτήτων της αλληλεπίδρασης, τα αποτελέσματα της οποίας βρίσκονται ακόμη σε πρώιμο στάδιο. Πρωταρχικά αποτελέσματα υποδηλώνουν μία ασθενή, εξώθερμη αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο πρωτεϊνών. Μελλοντικά πειράματα θα διαλευκάνουν περαιτέρω τον μηχανισμό της αλληλεπίδρασης οδηγώντας σε βαθύτερη κατανόηση των γεγονότων της ενδοκυττάρωσης καθώς και της βιολογικής σημασίας της αλληλεπίδρασης μεταξύ της κυτταροπλασματικής ακετοακετυλο-CoA θειολάσης με την Rab5. | el |
| heal.abstract | Endocytosis is a fundamental cellular process which allows cells not only to capture essential nutrients from extracellular space, but also to reorganize the composition of their plasma membrane and intracellular organelles, thus regulating various processes such as: cell proliferation, cell differentiation and apoptosis. The early stages of endocytosis are considered crucial, since they play an important role in defining the “fate” of the internalized “cargo”. Internalised proteins are directed to early endosomes, where a procedure known as “cargo sorting” takes place. While a considerable large number of proteins have been found to participate throughout early stages of endocytosis, the small GTPase Rab5 owns a dominant role. Rab5 assembles on early endosomes and mediates the capture of endocytic vesicles arriving from the plasma membrane. As a small G-protein, Rab5 undergoes two conformational changes depending on its nucleotide state. When GDP is bound on Rab5, the protein acquires its inactive conformation (Rab5-GDP) whereas GTP exchange participates in the transition of Rab5 in its activated form (Rab5-GTP). In order to achieve its multiple functions during the early stages of endocytosis, Rab5 must be activated (Rab5-GTP) and form interactions with a wide protein network, which contains more than 30 proteins, known as Rab5 effectors. In order to understand the molecular mechanisms of endocytosis, preceding studies identified an unknown interaction between the small GTPase Rab5 and the cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase or acetyl-CoA acetyltransferase 2 (ACAT2, EC 2.3.1.9). The cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase is involved in lipid metabolism and, more specifically, it constitutes the first enzyme of the pathway of mevalonate synthesis, in the cholesterol biosynthesis pathway. A recent study proved that cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase has, also, protein acetyltransferase activity, rendering the enzyme a potent regulator of other proteins’ functions. The fact that a principally metabolic enzyme seems to interact with a master regulator of early endocytosis events (Rab5), leads to essential questions about the interaction’s specificity and its biophysical properties. Furthermore, the interaction between cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase and Rab5 could imply a significant and even unknown role in many cellular processes. At the present dissertation, we investigated whether the interaction between cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase and Rab5 is direct (without necessary mediation of another protein). To fulfill that purpose, both proteins were overexpressed and purified in bacteria. At first, both proteins were overexpressed in appropriate bacterial strain and coupled with GST tag, in order to be efficiently purified. Subsequently, the GST moiety was removed with enzymatic proteolysis in order to produce cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase in pure form. On the other hand, Rab5 maintained the GST moiety. Then, both proteins were incubated in vitro and pull down assay was conducted using affinity chromatography column with glutathione beads. The procedure was followed by column’s washes using appropriate buffer, in order to remove the unbound fraction of cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase. Then, the portion of cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase that remained bound was eluted using a buffer containing EDTA. EDTA is a strong chelating agent, which, by removing the Mg2+/GDP complex from Rab5, modifies its conformation and leads to specific elution of bound proteins. The eluted samples were analyzed, further, using polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 12%) followed by Western blot analysis utilizing specific polyclonal antibodies against cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase epitopes. We observed that Rab5 interacts with cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase when both proteins are produced in pure form in heterologous bacterial strain, which proves that their interaction takes place directly, without intervention of another factor. Also, cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase seems to interact with Rab5 in a dose-dependent manner. Moreover, cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase interacts specifically only with the inactive conformation of Rab5, namely when Rab5 is bound with GDP nucleotide, and not non-specifically with glutathione beads or other homologous Rab proteins. Finally, we conducted a series of experiments in order to determine the interaction’s thermodynamic parameters, whose results are in preliminary stage. Nevertheless, primary observations imply a weak, exothermic interaction between cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase and Rab5. Future studies will shed light on defining the exact molecular mechanism of the interaction leading in deeper understanding of endocytosis at molecular level as well as clarifying the biological significance of the interaction between cytosolic acetoacetyl-CoA thiolase and Rab5. | en |
| heal.advisorName | Χριστοφορίδης, Σάββας | el |
| heal.committeeMemberName | Χριστοφορίδης, Σάββας | el |
| heal.academicPublisher | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής | el |
| heal.academicPublisherID | uoi | - |
| heal.numberOfPages | 96 σ. | - |
| heal.fullTextAvailability | true | - |
| Appears in Collections: | Διατριβές Μεταπτυχιακής Έρευνας (Masters) - ΙΑΤ | |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Μ.Ε. ΤΣΑΛΑΓΡΑΔΑΣ ΠΕΤΡΟΣ 2018.pdf | 2.8 MB | Adobe PDF | View/Open |
This item is licensed under a Creative Commons License
