Please use this identifier to cite or link to this item:
https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/27850Full metadata record
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.author | Κετίκογλου, Μαρία-Χριστίνα | el |
| dc.date.accessioned | 2017-03-07T09:40:40Z | - |
| dc.date.available | 2017-03-07T09:40:40Z | - |
| dc.identifier.uri | https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/27850 | - |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.26268/heal.uoi.1887 | - |
| dc.rights | Default License | - |
| dc.subject | Καταλυτική υπομονάδα | el |
| dc.subject | Ρυθμιστική υπομονάδα | el |
| dc.subject | Βακουλοϊός | el |
| dc.subject | Αναστολέας | el |
| dc.subject | PIK3CA gene | en |
| dc.subject | E545K mutation | en |
| dc.subject | HI047R mutation | en |
| dc.title | Παραγωγή των ογκογόνων μεταλλαγμένων μορφών της Ρ13 κινάσης σε ανασυνδυασμένη μορφή και εύρεση ειδικών αναστολέων με πιθανή φαρμακευτική σημασία | el |
| heal.type | masterThesis | - |
| heal.type.en | Master thesis | en |
| heal.type.el | Μεταπτυχιακή εργασία | el |
| heal.classification | Βακουλοϊοί | el |
| heal.dateAvailable | 2017-03-07T09:41:40Z | - |
| heal.language | el | - |
| heal.access | free | - |
| heal.recordProvider | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής | el |
| heal.publicationDate | 2017 | - |
| heal.bibliographicCitation | Βιβλιογράφία : σ. 58-65 | el |
| heal.abstract | Το ένζυμο ΡΙ3 κινάση είναι ένα ετεροδιμερές μόριο που αποτελείται από μια ρυθμιστική (ρ85α) και μια καταλυτική (ρ110α) υπομονάδα. Η καταλυτική υπομονάδα ρ110α (PIK3CA) βρίσκεται συχνά μεταλλαγμένη σε πολλούς τύπους καρκίνου του ανθρώπου. Οι μεταλλαγές σε αυτό το γονίδιο εντοπίζονται συνήθως σε συγκεκριμένα σημεία που ονομάζονται ‘θερμά σημεία’. Δύο από τις συχνότερες μεταλλαγές είναι η Ε545Κ και H1047R, στην ελικοειδή και στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου, αντίστοιχα. Μεγάλο ενδιαφέρον στη διεθνή βιβλιογραφία παρουσιάζει η εύρεση αναστολέων που στοχεύουν ειδικά ενάντια στη μεταλλαγμένη μορφή του ενζύμου, ενώ αφήνουν ανέπαφο το φυσιολογικό, με σκοπό τη μειωμένη τοξικότητα. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η παραγωγή λειτουργικής ΡΙ3Κ σε ανασυνδυασμένη μορφή, τόσο της φυσιολογικής όσο και των μεταλλαγμένων μορφών της, και η εύρεση ειδικών αναστολέων έναντι των μεταλλαγμένων μορφών. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε το σύστημα έκφρασης βακουλοϊού Bac-to-Bac (Invitrogen), που επιτρέπει την ταχεία παραγωγή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μεγάλες ποσότητες, ακόμα και πρωτεϊνών μεγάλου μοριακού βάρους, όπως η p110α. Αν και η απόδοση της έκφρασης δεν ήταν υψηλή, πραγματοποιήθηκε η έκφραση τόσο της φυσιολογικής (wt) όσο και της μεταλλαγμένης (Ε545Κ, H1047R) καταλυτικής υπομονάδας (p110α). Ο έλεγχος των επιπέδων έκφρασης πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια αντισώματος αντι-p110α. Καλύτερη έκφραση φάνηκε να έχει το γονίδιο της ρυθμιστικής υπομονάδας (PIK3R1). Για να διερευνηθεί εάν τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης της καταλυτικής υπομονάδας οφείλονται σε χαμηλή ανιχνευτική ικανότητα του αντισώματος, το cDNA της καταλυτικής υπομονάδας εκφράστηκε συντηγμένο με την EGFP στα κύτταρα ΗΕΚ293. Η σύγκριση της εικόνας της έκφρασης της πρωτεΐνης, με τη χρήση των αντισωμάτων αντι-GFP και αντι- PIK3CA, έδειξε ότι το αντίσωμα της p110α υπολείπεται σε ευαισθησία έναντι του αντι-GFP αντισώματος, γεγονός που πρέπει να ληφθεί υπόψη κατά την εκτίμηση της έκφρασης της p110α. Παράλληλα, μελετήθηκαν μόρια που σχεδιάστηκαν ως υποψήφιοι αναστολείς της μεταλλαγμένης μορφής Ε545Κ, σε in vitro πειράματα μέτρησης ενεργότητας της κινάσης. Το μόριο BRF-037 φαίνεται να αποτελεί έναν ικανοποιητικό αναστολέα, ειδικό για την μεταλλαγμένη μορφή. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία μπήκαν οι βάσεις ώστε, μετά από μια μελλοντική βελτίωση των συνθηκών έκφρασης και καθαρισμού του πρωτεϊνικού συμπλόκου ρ85α/ρ110α, να παραχθεί η PI3K σε ανασυνδυασμένη μορφή. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκε ένας νέος, εξειδικευμένος, αναστολέας της ρ110α Ε545Κ, ο οποίος πιθανά να αποδειχθεί ένα νέο φάρμακο έναντι της μεταλλαγμένης μορφής της ΡΙ3Κ. | el |
| heal.abstract | PI3K is a heterodimer consisted by a regulatory (p85α) and a catalytic (p110α) subunit. The catalytic subunit p110α (encoded by PIK3CA gene) is frequently mutated in many types of human cancer. Mutations on the gene are mainly found on specific regions named ‘hotspots’. H1047R and E545K are two ‘hot spot’ mutations on the catalytic and on the helical domain of the enzyme, respectively. Recent studies are focusing on discovering inhibitors that will specifically target the mutated form of the enzyme, leaving intact the normal one, thus eliminating toxicity. The aim of this study was the production of functional normal and mutated ΡΗ3Κ in the lab and the discovery of potent inhibitors that will specifically target the mutated forms. In order to do that, the baculovirus expression system Bac-to-Bac (Invitrogen) was used, which allows the rapid production of recombinant proteins in large amounts, even for those with high molecular weight, like p110α. The production of the normal (wt) and mutated (E545K, H1047R) catalytic subunit was achieved, although the expression levels weren’t high. For the detection of the levels of protein expression an anti-p110α antibody was used. The gene of the regulatory subunit (PIK3R1) seemed to be expressed better than the other subunits. To examine if the low expression levels of the catalytic subunit were due to the low detection efficiency of the p110α antibody, the cDNA of the catalytic subunit was expressed in HEK293 cells, in fusion with the EGFP protein. The comparison of the expression levels detected by the two antibodies, anti-GFP and anti-PIK3CA, showed that the sensitivity of the antibody for the p110α subunit was inferior to that of the anti-GFP antibody, a fact that should be considered when evaluating the expression of p110α. In parallel, compounds designed as candidate inhibitors of the mutated form E545K, were tested in an in vitro assay for the PI3 kinase activity. BRF-037 compound was found to be an efficient and specific inhibitor of the mutated protein. In conclusion, the foundations were laid in this dissertation, so that the production of recombinant PI3K will be achieved, after future optimization of the parameters of expression and purification of the p85α/p110α protein complex. Furthermore, a new specific inhibitor of the p110α-Δ545Κ was identified, which can possibly be proved to be a new drug against the mutated PI3K. | en |
| heal.advisorName | Χριστοφορίδης, Σάββας | el |
| heal.committeeMemberName | Χριστοφορίδης, Σάββας | el |
| heal.committeeMemberName | Φριλίγγος, Ευστάθιος | el |
| heal.committeeMemberName | Τζαβάρας, Θεόδωρος | el |
| heal.committeeMemberName | Κωλέττας, Ευάγγελος | el |
| heal.committeeMemberName | Κούκλης, Παναγιώτης | el |
| heal.academicPublisher | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής | el |
| heal.academicPublisherID | uoi | - |
| heal.numberOfPages | 65 σ. | - |
| heal.fullTextAvailability | true | - |
| Appears in Collections: | Διατριβές Μεταπτυχιακής Έρευνας (Masters) - ΙΑΤ | |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Μ.Ε. ΚΕΤΙΚΟΓΛΟΥ ΜΑΡΙΑ-ΧΡΙΣΤΙΝΑ 2017.pdf | 2.74 MB | Adobe PDF | View/Open |
This item is licensed under a Creative Commons License
