Please use this identifier to cite or link to this item:
https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/27814Full metadata record
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.author | Γκάρτζιου, Φωτεινή Α. | el |
| dc.date.accessioned | 2017-02-06T07:31:05Z | - |
| dc.date.available | 2017-02-06T07:31:05Z | - |
| dc.identifier.uri | https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/27814 | - |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.26268/heal.uoi.3355 | - |
| dc.rights | Default License | - |
| dc.subject | DNA | en |
| dc.subject | Νευρολογικά κύτταρα | el |
| dc.subject | Μεταθετά στοιχεια | el |
| dc.title | Μελέτη του μηχανισμού ρύθμισης της ρετρομετάθεσης σε νευρολογικά κύτταρα | el |
| dc.title | Study on the regulatory mechanism of retrotransposition in human neuroglial cells | en |
| heal.type | doctoralThesis | - |
| heal.type.en | Doctoral thesis | en |
| heal.type.el | Διδακτορική διατριβή | el |
| heal.classification | DNA | en |
| heal.dateAvailable | 2017-02-06T07:32:05Z | - |
| heal.language | el | - |
| heal.access | free | - |
| heal.recordProvider | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής | el |
| heal.publicationDate | 2016 | - |
| heal.bibliographicCitation | Βιβλιογράφία : σ. 173-200 | el |
| heal.abstract | Τα ρετρομεταθετά στοιχεία αποτελούν διάσπαρτες, μετρίως επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του γενώματος των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισμών, ενώ στον άνθρωπο συγκεκριμένα συνιστούν το 50% του γενώματός του. Τις τελευταίες δεκαετίες προσελκύουν ολοένα και μεγαλύτερο επιστημονικό ενδιαφέρον χάρις στην ιδιότητα της μετάθεσης που φέρουν, ενσωματώνοντας νέα αντίγραφά τους τυχαία σε νέες θέσεις εντός του γενώματος. Με τον τρόπο αυτό δύνανται να συμβάλουν στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης αλλά και σε αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση. Μεταξύ αυτών των στοιχείων συγκαταλέγονται και οι ανθρώπινοι ενδογενείς ρετροϊοί (HERVs), οι οποίοι συνιστούν ~8% του ανθρώπινου γενώματος και φέρουν δομική ομολογία με τους εξωγενείς ρετροϊούς. Τα στοιχεία αυτά πιθανώς προέκυψαν από ενσωματώσεις - διαμεσολαβούμενες από την αντίστροφη μεταγραφάση - σε κύτταρα της αναπαραγωγικής σειράς προγόνων του Homo Sapiens, που ακολούθησαν της αρχικής τους μόλυνσης από εξωγενείς ρετροϊούς. Πολλές από τις ακολουθίες HERV στο ανθρώπινο γένωμα είναι ατελείς αν και έχουν ανιχνευθεί κάποιες πλήρους μήκους προϊικές γενωμικές ακολουθίες. Κάποιοι από αυτούς του προϊούς διαθέτουν ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης ικανά να κωδικοποιούν πλήρεις ιϊκές πρωτεΐνες ή και να παράγουν ιϊκά σωματίδια. Η ιστο-ειδική έκφραση ορισμένων HERVs έχει συσχετιστεί με αρκετές χρόνιες ασθένειες στον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένων της πολλαπλής σκλήρυνσης, του σακχαρώδους διαβήτη, της αυτοάνοσης αρθρίτιδας, αλλά και κάποιων τύπων καρκίνου. Τα ανθρώπινα γλοιώματα συνιστούν την μεγαλύτερη κατηγορία ενδοκρανιακών όγκων. Αποτελούν όγκους που επιδεικνύουν έντονη ετερογένεια σε πολλαπλά επίπεδα που αφορούν στην διαμόρφωση του φαινοτύπου, στην γενετική και επιγενετική τους σύσταση, στο δυναμικό πολλαπλασιασμού τους, καθώς και στο δυναμικό μεταναστευτικότητας, ογκογενετικότητας και ανθεκτικότητάς τους. Πολλές από αυτές τις ιδιότητες αποδίδονται στα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (Cancer Stem Cells: CSCs) τα οποία μπορούν να προκύψουν είτε μέσω αυξημένου αριθμού συμμετρικών κυτταρικών διαιρέσεων (selfrenew) των CSCs είτε μέσω επαναπρογραμματισμού των μη-CSCs σε CSCs, συνεισφέροντας έτσι στην φαινοτυπική πλαστικότητα του κυτταρικού πληθυσμού που συνιστά έναν γλοιωματικό όγκο. Υπέρτατο στόχο των CSCs αποτελεί η επιβίωσή τους και προκειμένου να την επιτύχουν εκμεταλλεύονται στο έπακρον ή και ανατρέπουν ολοσχερώς τον κυτταρικό μηχανισμό, μέσω του πολλαπλασιασμού, της από- διαφοροποίσηση ή ακόμα και της δια-διαφοροποίησης. Σκοπό της διατριβής αυτής αποτέλεσε η διερεύνηση τριών κρίσιμων ερωτημάτων, εάν: 1. γεγονότα ρετρομετάθεσης λαμβάνουν χώρα σε ανθρώπινα γλοιωματικά κύτταρα, 2. οι επιπτώσεις της ρετρομετάθεσης συσχετίζονται με μείζονα κυτταρικά φαινόμενα που απαντώνται σε γλοιωματικούς όγκους όπως είναι η φαινοτυπική ετερογένεια, το δυναμικό πολλαπλασιασμού, η ογκογενετικότητα και μεταστατικότητα και 3. η ρετρομετάθεση υπόκειται σε επιγενετικούς ή άλλους μηχανισμούς ρύθμισης σε γλοιωματικά κύτταρα Στην παρούσα εργασία, το πρώτο ερώτημα προσεγγίστηκε μέσω διαμόλυνσης δύο ανθρώπινων γλοιωματικών κυτταρικών σειρών (U-373- και U-87 MG) με το μη- αυτόνομο, LTR-ρετροτρανσποζόνιο, HERV-K10, η οποία οδήγησε στην παραγωγή υψηλής συχνότητας ρετρομετάθεσης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Μάλιστα στα κύτταρα U87 ανιχνεύθηκαν σταθερά σημαντικά υψηλότερες συχνότητες ρετομετάθεσης, συγκριτικά με τα U-373, οι οποίες άγγιξαν το ποσοστό του 25%. Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν ότι τα ανθρώπινα κύτταρα γλοιώματος αποτελούν ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την πραγματοποίηση γεγονότων ρετρομετάθεσης. Όσον αφορά το δεύτερο σκέλος του σκοπού της παρούσας διατριβής, αποδείξαμε ότι: α. η ρετρομετάθεση των στοιχείων HERV-K10 σε κύτταρα U-373 συσχετίζεται με φαινόμενα κυτταρικής διαφοροποίησης προγονικών γλοιωματικών κυττάρων προς έναν πιο ώριμο αστροκυτταρικό φαινότυπο, β. η παραγωγή υψηλότερης συχνότητας ρετρομετάθεσης σε κύτταρα U-87 συσχετίζεται με φαινόμενα κυτταρικού επανα- προγραμματισμού (cell reprogramming) ή δια-διαφοροποίησης (trans-differentiatio) προγονικών αστρογλοιωματικών κυττάρων προς έναν νευρο-ειδικό φαινότυπο. Οι παρατηρήσεις αυτές στοιχειοθετήθηκαν τόσο μέσω αξιολόγησης του προκύπτοντος κάθε φορά φαινότυπου, όσο και μοριακά, μέσω ταυτοποίησης ειδικών πρωτεϊνικών δεικτών αστροκυτταρικής (GFAP-θετικά κύτταρα) και νευρωνικής (βIII-τουμπουλίνη-θετικά κύτταρα) διαφοροποίησης. Επιπλέον στοιχείο που συνεπικουρεί στην στοιχειοθέτηση της κυτταρικής διαφοροποίησης ήταν γ. και οι εξαιρετικά χαμηλοί ρυθμοί πολλαπλασιασμού που χαρακτήριζαν τα θετικά ρετρομετάθεσης κύτταρα αμφότερων των κυτταρικών σειρών. Ο μειωμένος ρυθμός πολλαπλασιασμού συνοδεύτηκε από εκτεταμένες διαταραχές του κυτταρικού κύκλου και στις δύο κυτταρικές σειρές, ενώ επιπρόσθετα για τα κύτταρα U-87 ανιχνεύθηκαν χρωμοσωματικές υπερπλοειδίες (τετραπλοειδίες). Τέλος, η επαγωγή της συχνότητας ρετρομετάθεσης από τον παράγοντα κυτταρικής διαφοροποίησης των νευρικών κυττάρων, ρετινοϊκό οξύ, ενισχύει ακόμη περισσότερο την υπόθεση εργασίας που συσχετίζει την ρετρομετάθεση με την κυτταρική διαφοροποίηση των γλοιωματικών κυττάρων. Παραμένοντας σε αυτό το σκέλος του σκοπού μας, αποδείξαμε επιπλέον ότι ο επαγόμενος από ρετρομετάθεση κυτταρικός επανα-προγραμματισμός κυττάρων U-87 επετεύχθη μέσω από-διαφοροποίησής τους προς ένα ενδιάμεσο προγονικό/βλαστικό στάδιο (ενεργοποίηση καρκινικών βλαστικών κυττάρων). Προς αυτή την κατεύθυνση, αποδείξαμε ότι τα θετικά ρετρομετάθεσης κύτταρα U-87, καλλιεργούμενα απουσία κατάλληλου υποστρώματος προσκόλλησης, ήταν ικανά να παράξουν μεγάλες σε αριθμό και μέγεθος νευρόσφαιρες, οι οποίες εξέφραζαν τους πρωτεϊνικούς δείκτες βλαστικότητας νεστίνη, Sox2, Oct-4 και CD133. Επιπλέον, οι νευρόσφαιρες αυτές, που βρέθηκαν ισχυρά θετικές σε ρετρομετάθεση (μέχρι και 80%), ήταν ικανές να αυτό-ανανεώνονται και καλλιεργούμενες υπό φυσιολογικές συνθήκες κυτταρικής προσκόλλησης, να διαφοροποιούνται στους δύο κύριους κυτταρικούς τύπους του νευρικού ιστού που είναι τα αστροκύτταρα και οι νευρώνες. Οι δύο αυτές ιδιότητες (αυτό-ανανέωση και πολλαπλό δυναμικό διαφοροποίησης) χαρακτηρίζουν και στοιχειοθετούν την ύπαρξη καρκινικών βλαστικών κυττάρων, μετά την ενσωμάτωση νέων HERV-K10 αντιγράφων στο γένωμα. Η παραγωγή καρκινικών βλαστικών κυττάρων ως συνέπεια της ρετρομετάθεσης σε κύτταρα U-87, οδήγησε σε ενίσχυση του ογκογενετικού και μεταστατικού τους δυναμικού. Οι παρατηρήσεις αυτές σημειώθηκαν και σε κύτταρα U373-θετικά ρετρομετάθεσης, παρόλο που αυτά δεν σχημάτισαν νευρόσφαιρες. Πιθανός όμως το γεγονός ότι υπερέκφραζαν το αντιγονικό επίτοπο CD44, ο οποίος σε ανθρώπινα γλοιώματα ενοχοποιείται για την ενίσχυση της ογκογενετικότητας και μεταναστευτικότητας, να δικαιολογεί αυτό μας το αποτέλεσμα. Όσον αφορά το τρίτο σκέλος του σκοπού της διδακτορικής αυτή διατριβής, αποδείξαμε ότι η ρετρομετάθεση του προϊού HERV-K10 και η επαγόμενη από αυτήν κυτταρική διαφοροποίηση σε γλοιωματικά κύτταρα, υπόκεινται σε μηχανισμούς επιγενετικής ρύθμισής τους. Πιο ειδικά, η επίδραση κυττάρων U-373 και U-87 (χρησιμοποιήθηκαν κλώνοι με χαμηλή ρετρομετάθεση ως κυτταρικά συστήματα μελέτης) με παράγοντες επιγενετικής δράσης, όπως ο αναστολέας των ιστονικών από-ακετυλασών, βαλπροϊκό οξύ ή ο απο-μεθυλιωτικός παράγοντας 5-αζακυτιδίνη, επήγαγαν την συχνότητα ρετρομετάθεσης των στοιχείων HERV-K10. Η επαγόμενη από βαλπροϊκό οξύ ή 5- αζακυτιδίνη ρετρομετάθεση επέφερε κυτταρική διαφοροποίηση στα υπό-μελέτη κυτταρικά συστήματα που στοιχειοθετήθηκε σε επίπεδο φαινότυπου αλλά και μοριακά με την ταυτοποίηση των δεικτών διαφοροποίησης GFAP και βIII-τουμπουλίνης. Επιπλέον, τα κύτταρα στα οποία έγινε επίδραση με βαλπροϊκό οξύ ή 5-αζακυτιδίνη διαπιστώθηκε δοσο- εξαρτώμενη αναστολή του κυτταρικού τους κύκλου, σε διαφορετικά για κάθε περίπτωση ουσίας σημεία ελέγχου. Τέλος, γνωρίζοντας ότι η αντίστροφη μεταγραφή αποτελεί ένα θεμελιώδους σημασίας στάδιο της διαδικασίας ρετρομετάθεσης, θελήσαμε να διερευνήσουμε της επιπτώσεις της αναστολής της στην ρετρομετάθεση και την επαγόμενη από ρετρομετάθεση κυτταρική διαφοροποίηση. Προς αυτή την κατεύθυνση, κύτταρα U-373 και U-87 τα οποία προ- επωάστηκαν με τον αναστολέα των ενδογενών αντίστροφων μεταγραφασών Efavirenz, εκτέθηκαν εκ νέου στον ακετυλιωτικό παράγοντα βαλπροϊκό οξύ. Διαπιστώσαμε ότι η ανασταλτική δράση του Efavirenz στην επαγόμενη από βαλπροϊκό οξύ ρετρομετάθεση, απέτρεψε και την συντελούμενη από ρετρομετάθεση κυτταρική διαφοροποίηση στα υπό μελέτη κυτταρικά συστήματα. Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη παρέχει για πρώτη φορά αξιόπιστη πειραματική μαρτυρία που συσχετίζει μερικά από τα κυριότερα κυτταρικά φαινόμενα που απαντώνται στους ανθρώπινους γλοιωματικούς όγκους όπως είναι η έντονη φαινοτυπική ετερογένεια, οι διαταραχές του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, η ογκογενετικότητα και μεταστατικότητα, με το φαινόμενο της ρετρομετάθεσης. Επιπλέον, αναδεικνύεται ότι η ρύθμιση της ρετρομετάθεσης είτε μέσω επιγενετικών μηχανισμών είτε μέσω αναστολής της αντίστροφης μεταγραφής, μπορεί να επηρεάσει την πορεία διαφοροποίησης των γλοιωματικών κυττάρων, ένα στάδιο που από πολλές μελέτες θεωρείται καθοριστικής σημασίας για την έναρξη και εξέλιξη των ενδοκρανιακών όγκων. | el |
| heal.abstract | Retrotransposons are interspersed, moderately repetitive DNA sequences of prokaryotic and eukaryotic genomes, while in humans account for almost half of the genome. The last decades, they attract more and more intensely the scientific interest thanks to their ability to transpose, integrating randomly new copies of themselves into new genomic loci. In that way, they are able to reshuffle the genome and alter gene expression. Among these elements are Human Endogenous Retroviruses (HERVs) which comprise almost 8% of the human genome and have structural homology to exogenous retroviruses. These elements probably arose from reverse transcriptase-mediated integration into the germ line of progenitors of Homo sapiens after exogenous retroviral infection. Many of the HERV sequences in the human genome are incomplete, although some full-length proviral genomic sequences have been identified. Some of these proviruses contain long open reading frames capable of encoding complete viral proteins and producing viral particles. The tissue-specific expression of HERVs has been associated with a number of chronic human diseases, including multiple sclerosis, diabetes, autoimmune arthritis and some types of cancer. Human gliomas represent the largest group of intracranial tumors. Gliomas display high degree of phenotypic, genetic, epigenetic, proliferative, metastatic, tumorigenic and resistance heterogeneity. Some of these characteristics are attributed to Cancer Stem Cells (CSCs). CSCs enrichment may derive either from an increased symmetric self-renewal division rate of CSCs or a reprogramming of non-CSCs to CSCs and conferring phenotypic plasticity to the tumor population. CSCs are the ultimate survivors and will exploit and subvert the cellular machinery to achieve that goal, by proliferation, dedifferentiation, and even transdifferentiation. Aim of the present dissertation was to investigate three crucial questions, whether: 1. retrotransposition events occur in human glioma cells, 2. the outcome of retrotransposition is associated with major cellular events, commonly characterizing the human gliomas, such as phenotypic heterogeneity, cell proliferation disturbances, tumorigenisity and metastasis, and 3. retrotransposition in human gliomas is under epigenetic or other regulation mechanisms. The first part of that question was approached through transfection of the nonautonomous, LTR-retrotransposon HERV-K10 in human U-373 and U-87 glioma cell lines, which produced high retrotransposition frequencies in both cell lines. Indeed, in U- 87 cells higher retrotransposition frequencies were detected, up to 25%, indicating that human glioma cells represent a favorable environment for retrotransposition occurrence. With regard to the second part of this study’s aim, we showed that: a. HERV-K10 retrotransposition in U-373 glioma cells is correlated with astrocytic differentiation; b. the production of higher retrotransposition frequencies in U-87 cells is correlated with glioma cells transdifferentiation/reprogramming into a neuronal phenotype. These findings were confirmed on the basis of phenotypic changes through morphological examination of the resultant phenotype and molecular identification of specific astrocytic (GFAP-positive cells) and neuronal (βIII-tubulin) differentiation markers in both cell lines. On that direction, we also found that retrotransposition-positive cells exhibited lower proliferative rates compared to parental cells, a finding which further confirms the end-point of cell differentiation process. These low proliferative rates were accompanied by extended cell cycle disturbances in both cell lines in addition to hyperploidy (tetraploidy) development in U-87 cells. Finally, the induction of retrotransposition frequency by the differentiation factor retinoic acid, provides another strong support to our hypothesis that retrotransposition is correlated to glioma cells differentiation. In keeping with this part of our study’s aim, we showed that in the case of U-87 cells, retrotransposition-induced trans-differentiation from astroglial to a neuronal phenotype took place through de-differentiation into an intermediate progenitor/stem cell stage. In particular, retrotransposition-positive U-87 cells were able to form a large number of robust neurospheres under low-binding growth condition, which expressed the stem cell markers nestin, Sox2, Oct-4 and CD133. These neurospheres were found to be strongly positive for retrotransposition (up to 80%) and also were able to renew and differentiate into the two main lineages (astrocytes and neurons) of the nervous tissue when cultured under normal binding growth conditions. The properties of renewal and differentiation unambiguously support cancer stem cells formation. The formation of retrotransposition-induced cancer stem cells was characterized by an in vitro increased tumorigenic and metastatic potential. These results were also observed in the case of U-373 retrotransposition-positive cells, although these particular cells did not produce cancer stem cells. Probably, overexpression of CD44, a marker implicated in increased tumorigenicity and metastasis of gliomas, justifies that outcome of retrotransposition-positive U-373 cells. With regard to the third part of this study’s aim, we have shown that retrotransposition-induced differentiation of glioma cells is under epigenetic regulation mechanisms. Specifically, treatment of U-373 and U-87 cells with drugs exerting epigenetic activity such as the histone deacetylase inhibitor, valproic acid or DNA methyltrasferase inhibitor, 5΄-aza-2-deoxycytidine, induced retrotransposition. VPA- or 5- aza-induced retrotransposition was correlated with glioma cells differentiation that was confirmed at the basis of phenotypical examination and verified with astrocytic (GFAP) and neuronal (βII-tubulin) differentiation markers expression. Moreover, VPA- or 5-azatreated cells exhibited a dose-dependent cell cycle arrest in different, for each drug, checkpoints. Finally, knowing that reverse transcription is a fundamental stage of retrotranspostion, we investigated the outcome of reverse transcription inhibition in retrotransposition and retrotransposition-induced glioma cells differentiation. In that direction, U-373 and U-87 cells pre-treated with the reverse transcriptase inhibitor, efavirentz, were re-exposed to valproic acid. We discovered that both VPA-induced retrotransposition and retrotransposition-induced differentiation in treated cells were inhibited by efavirenz. Conclusively, the present study provides, for the first time, experimental evidence correlating major cellular events characterizing human gliomas, such as phenotypical heterogeneity, cell proliferation disturbances, tumorigenicity and metastasis with the phenomenon of HERV-K10 provirus retrotransposition. Additionally, it highlights that the regulation of retrotransposition through epigenetic mechanisms or reverse transcription inhibition, may influence the direction of glioma cells differentiation, which is considered to be a very important stage of brain tumors initiation and progression. | en |
| heal.advisorName | Κυρίτσης, Αθανάσιος | el |
| heal.committeeMemberName | Κυρίτσης, Αθανάσιος | el |
| heal.committeeMemberName | Γεωργίου, Ιωάννης | el |
| heal.committeeMemberName | Βούλγαρης, Σπυρίδων | el |
| heal.committeeMemberName | Κωλέττας, Ευάγγελος | el |
| heal.committeeMemberName | Τζαβάρας, Θεόδωρος | el |
| heal.committeeMemberName | Βρεκούσης, Θωμάς | el |
| heal.committeeMemberName | Κούκλης, Παναγιώτης | el |
| heal.academicPublisher | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής | el |
| heal.academicPublisherID | uoi | - |
| heal.numberOfPages | 200 σ. | - |
| heal.fullTextAvailability | true | - |
| Appears in Collections: | Διδακτορικές Διατριβές - ΙΑΤ | |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Δ.Δ. ΓΚΑΡΤΖΙΟΥ ΦΩΤΕΙΝΗ Α. 2016.pdf | 31.04 MB | Adobe PDF | View/Open |
This item is licensed under a Creative Commons License
