Please use this identifier to cite or link to this item:
https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/39664Full metadata record
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.author | Κωνσταντόπουλος, Μάριος | el |
| dc.date.accessioned | 2025-12-04T09:50:54Z | - |
| dc.date.available | 2025-12-04T09:50:54Z | - |
| dc.identifier.uri | https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/39664 | - |
| dc.rights | Attribution 3.0 United States | * |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/us/ | * |
| dc.subject | Δομική Βιολογία και Βιοχημεία | el |
| dc.subject | Κρυσταλλογραφία πρωτεϊνών | el |
| dc.subject | Περίθλαση ακτινών-Χ | el |
| dc.subject | Πολυκρυσταλλικά δείγματα | el |
| dc.subject | Ανθρώπινη ινσουλίνη | el |
| dc.subject | Ρεσορσινόλη | el |
| dc.subject | 4-Χλωρορεσορσινόλη | el |
| dc.subject | Πολυμορφισμός | el |
| dc.subject | Λυσοζύμη από ασπράδι αυγού της όρνιθας | el |
| dc.subject | Σχετική υγρασία | el |
| dc.subject | Σχεδιασμός φαρμάκων | el |
| dc.title | Συνδυαστική χρήση βιοφυσικών και βιοχημικών μεθόδων για τον δομικό χαρακτηρισμό φαρμακευτικών πρωτεϊνών και πεπτιδίων | el |
| dc.type | masterThesis | en |
| heal.type | masterThesis | el |
| heal.type.en | Master thesis | en |
| heal.type.el | Μεταπτυχιακή εργασία | el |
| heal.classification | Ανόργανη Βιολογική Χημεία | el |
| heal.dateAvailable | 2025-12-04T09:51:55Z | - |
| heal.language | el | el |
| heal.access | free | el |
| heal.recordProvider | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών | el |
| heal.publicationDate | 2025-10-31 | - |
| heal.abstract | Στην παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία, πραγματοποιείται κρυσταλλογραφική μελέτη της επίδρασης διάφορων φυσικοχημικών παραμέτρων στον μοριακό και κρυσταλλικό πολυμορφισμό της ανθρώπινης ινσουλίνης παρουσία οργανικών προσδετών. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν in situ κρυσταλλογραφικές μελέτες της επίδρασης της σχετικής υγρασίας σε κρυστάλλους ανθρώπινης ινσουλίνης και λυσοζύμης από ασπράδι αυγού της όρνιθας. Πιο συγκεκριμένα, στον πρώτο άξονα της εργασίας, μελετώνται σύμπλοκα της ανθρώπινης ινσουλίνης παρουσία των οργανικών προσδετών ρεσορσινόλη και 4-χλωρορεσορσινόλη συναρτήσει του pH, καθώς και της συγκέντρωσης του προσδέτη στην περίπτωση της ρεσορσινόλης. Με σκοπό την δημιουργία πολυκρυσταλλικών δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν κρυσταλλώσεις με την μέθοδο batch. Για την μελέτη αξιοποιήθηκε εκτενώς η τεχνική περίθλασης ακτίνων-Χ από πολυκρυσταλλικά δείγματα (X-Ray Powder Diffraction – XRPD). Πειράματα περίθλασης που διεξάχθηκαν στον πειραματικό σταθμό ID22 της Ευρωπαϊκής Εγκατάστασης Ακτινοβολίας Σύγχροτρον (European Synchrotron Radiation Facility – ESRF), επέτρεψαν την συλλογή δεδομένων περίθλασης υψηλής ποιότητας. Μέσω ανάλυσης των δεδομένων XRPD ταυτοποιήθηκαν κρυσταλλικά πολύμορφα μονοκλινούς και ορθορομβικής συμμετρίας [P21(α), C2221, C2, P21(β)] για τα σύμπλοκα ανθρώπινης ινσουλίνης και ρεσορσινόλης, ενώ για τα σύμπλοκα ανθρώπινης ινσουλίνης και 4-χλωρορεσορσινόλης ταυτοποιήθηκαν κρυσταλλικά πολύμορφα μονοκλινούς συμμετρίας [P21(γ), P21(δ), C2, P21(β)]. Εκτός των προαναφερθέντων, σημαντικό εύρημα ήταν η ταυτοποίηση του νέου μονοκλινούς πολυμορφισμού P21(γ) στα σύμπλοκα με ρεσορσινόλη σε χαμηλά pH. Για την επαλήθευση του συγκεκριμένου ευρήματος πραγματοποιήθηκαν συγκρυσταλλώσεις ανθρώπινης ινσουλίνης και ρεσορσινόλης με την μέθοδο κρυστάλλωσης διάχυσης ατμών. Τα πειράματα περίθλασης διεξάχθηκαν στους πειραματικούς σταθμούς P13 του Γερμανικού Σύγχροτρον (PETRA III - Deutsches Elektronen-Synchrotron DESY) και ID23-2 του ESRF με την αξιοποίηση της τεχνικής περίθλασης ακτίνων-Χ από μονοκρύσταλλο (Single Crystal X-Ray Diffraction – SCXRD). Η πρωταρχική επεξεργασία και ανάλυση των δεδομένων SCXRD επιβεβαίωσε την ύπαρξη του συγκεκριμένου κρυσταλλικού πολυμόρφου με πλεγματικές σταθερές a=46.151 Å, b=68.905 Å, c=81.861 Å και β=104.704° σε εύρος ευκρίνειας 79.18 - 2.5 Å. Τέλος, παρουσιάζεται και η κοινή, ταυτόχρονη ανάλυση κατά Pawley δεδομένων XRPD, που προήλθαν από κρυστάλλους ανθρώπινης ινσουλίνης και ρεσορσινόλης μονοκλινούς συμμετρίας P21(β), η οποία αποτελεί το πρωταρχικό στάδιο με σκοπό την επίλυση της συγκεκριμένης δομής μέσω δεδομένων XRPD. Στο δεύτερο σκέλος της εργασίας, οι in situ XRPD κρυσταλλογραφικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν στο κρυσταλλικό σύμπλοκο ανθρώπινης ινσουλίνης και 4-χλωρορεσορσινόλης μονοκλινούς συμμετρίας P21(β) και σε κρυστάλλους λυσοζύμης τετραγωνικής συμμετρίας P43212. Τα πειράματα περίθλασης πραγματοποιήθηκαν στο εργαστηριακό περιθλασίμετρο X’Pert Pro (Malvern PANalytical), όπου και βρίσκεται εγκατεστημένος ο θάλαμος ελέγχου σχετικής υγρασίας και θερμοκρασίας MHC-trans (Anton Paar). Για την περίπτωση της ανθρώπινης ινσουλίνης και 4-χλωρορεσορσινόλης πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις υπό συνθήκες ελεγχόμενων μεταβολών της σχετικής υγρασίας (relative Humidity – rH) μέσω διαδοχικών αφυδατώσεων και επανενυδατώσεων. Η ανάλυση των δεδομένων XRPD έδειξε αντοχή του συγκεκριμένου συμπλόκου μέχρι και rH 50% με σαφή υποβάθμιση της κρυσταλλικότητάς του, η οποία όμως επανέρχεται εν μέρει με την επανενυδάτωσή του. Υπάρχουν αλλαγές στις πλεγματικές σταθερές της μοναδιαίας κυψελίδας, ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει η ανισοτροπική μεταβολή των πλεγματικών σταθερών. Για την περίπτωση της τετραγωνικής λυσοζύμης πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις υπό συνθήκες ελεγχόμενων μεταβολών της rH μέσω διαδοχικών αυξομειώσεων σε εύρος 95%-73%. Το πολύμορφο έδειξε μεγάλη ανθεκτικότητα, καθώς δεν παρατηρήθηκε αισθητή υποβάθμιση της κρυσταλλικότητάς του, και οι πλεγματικές σταθερές της μοναδιαίας μεταβάλλονται ανισοτροπικά. Και στις δύο περιπτώσεις της συγκεκριμένης μελέτης δεν παρατηρήθηκε μετάβαση κρυσταλλικής φάσης. Η σημασία των παραπάνω αποτελεσμάτων συμβάλλει ουσιαστικά στην έρευνα του σχεδιασμού φαρμάκων βάσει δομής (Structure-Based Drug Design - SBDD). Η λεπτομερής χαρτογράφηση των διάφορων πολυμόρφων και της σταθερότητάς τους υπό μεταβαλλόμενες φυσικοχημικές και περιβαλλοντικές συνθήκες παρέχει κρίσιμες πληροφορίες για την βελτιστοποίηση των συνθηκών αποθήκευσης και μεταφοράς φαρμακευτικών σκευασμάτων. Επιπλέον, η κατανόηση της δομικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνικών μορίων σε σχέση με προσδέτες και παράγοντες όπως η υγρασία και το pH, μπορεί να αξιοποιηθεί για την ανάπτυξη νέων αναλόγων με βελτιωμένο προφίλ φαρμακοκινητικής και φαρμακοδυναμικής. Η ενσωμάτωση τέτοιων δεδομένων στην αξιολόγηση παραμέτρων, όπως η απορρόφηση, η κατανομή, ο μεταβολισμός, η απέκκριση και η τοξικότητα (ADME-Tox) είναι καθοριστική για την επίτευξη φαρμακευτικών προϊόντων με αυξημένη αποτελεσματικότητα, σταθερότητα και ασφάλεια, υπογραμμίζοντας έτσι τον ρόλο της κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ ως εργαλείο αιχμής στην σύγχρονη Δομική Βιολογία και Βιοχημεία. | el |
| heal.abstract | In the present thesis, a crystallographic study is conducted on the effect of various physicochemical parameters on the molecular and crystalline polymorphism of human insulin in the presence of organic ligands. In addition, in situ crystallographic studies assessed the effect of relative humidity on crystals of human insulin and hen egg-white lysozyme. More specifically, in the first part of the study, complexes of human insulin in the presence of the organic ligands resorcinol and 4-chlororesorcinol are studied as a function of pH, as well as ligand concentration in the case of resorcinol. Batch crystallization was performed in order to generate polycrystalline samples. The technique of X-Ray Powder Diffraction (XRPD) was extensively employed and diffraction experiments carried out at beamline ID22 of the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) allowed the collection of high-quality diffraction data. Through analysis of the XRPD data, crystalline polymorphs of monoclinic and orthorhombic symmetry [P21(α), C2221, C2, P21(β)] were identified for the human insulin & resorcinol complexes, while for the human insulin & 4-chlororesorcinol crystalline polymorphs of monoclinic symmetry [P21(γ), P21(δ), C2, P21(β)] were identified. Notably, a novel crystalline polymorph of monoclinic symmetry, P21(γ), was identified in the case of insulin & resorcinol complexes at low pH values. To verify this finding, co-crystallizations of human insulin and resorcinol were performed using the vapor diffusion method. Diffraction experiments were conducted at beamline P13 of the German Synchrotron (DESY) and ID23-2 of the ESRF, utilizing the Single Crystal X-Ray Diffraction (SCXRD) technique. Preliminary processing and analysis of the SCXRD data confirmed the existence of this crystalline polymorph, with unit-cell parameters a=46.151 A, b=68.905 A, c=81.861 A and β=104.704° in a resolution range of 79.18 - 2.5 A. Finally, a combined Pawley refinement analysis of XRPD data obtained from insulin and resorcinol crystals of monoclinic symmetry P21(β) is presented, constituting the initial stage towards the structure solution of the aforementioned polymorph via XRPD data. In the second part of the work, in situ XRPD crystallographic studies were performed on the crystalline complex of human insulin and 4-chlororesorcinol of monoclinic symmetry P21(β), as well as on tetragonal lysozyme crystals of symmetry P43212. Diffraction experiments were carried out on the laboratory diffractometer X’Pert Pro (Malvern PANalytical) that is equipped with the MHC-trans (Anton Paar) relative humidity and temperature control chamber. For the human insulin and 4-chlororesorcinol complex, measurements were performed under controlled relative humidity (rH) variations through successive dehydration and rehydration cycles. Analysis of the XRPD data demonstrated the stability of this complex up to rH 50%, with a marked degradation of crystallinity that partially recovered upon rehydration. Changes in the unit-cell parameters were observed, with particular interest in the anisotropic variation of the lattice constants. For the tetragonal lysozyme, measurements under controlled non-gradual rH variations in the range of 95%-73% revealed high resilience, with no significant degradation of crystallinity. Anisotropic changes of the unit-cell parameters were observed too. In both cases of this study axis, no crystal phase transitions were detected. The significance οf these results contribute substantially to research in Structure-Based Drug Design (SBDD). The detailed mapping of various polymorphs and their stability under varying physicochemical and environmental conditions provides critical information for optimizing the storage and transport conditions of pharmaceutical formulations. Furthermore, understanding the structural behavior of protein molecules in relation to ligands and factors such as humidity or pH can be exploited for the development of new analogues with improved pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles. Considering such data for the evaluation of parameters such as absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADME-Tox) is crucial for the development of pharmaceutical products with enhanced efficacy, stability, and safety, thus underscoring the role of X-ray crystallography as a cutting-edge tool in modern Structural Biology and Biochemistry. | en |
| heal.advisorName | Μαργιωλάκη, Ειρήνη | el |
| heal.committeeMemberName | Μαργιωλάκη, Ειρήνη | el |
| heal.committeeMemberName | Περλεπές, Σπυρίδων | el |
| heal.committeeMemberName | Σταματάτος, Θεοχάρης | el |
| heal.academicPublisher | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Χημείας | el |
| heal.academicPublisherID | uoi | el |
| heal.numberOfPages | 159 | el |
| heal.fullTextAvailability | true | - |
| Appears in Collections: | Διατριβές Μεταπτυχιακής Έρευνας (Masters) - ΧΗΜ | |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Μ.Ε. ΚΩΝΣΤΑΝΤΟΠΟΥΛΟΣ ΜΑΡΙΟΣ 2025.pdf | 17.41 MB | Adobe PDF | View/Open |
This item is licensed under a Creative Commons License
