Please use this identifier to cite or link to this item:
https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/33114Full metadata record
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.author | Καρρά, Αθηνά-Βασιλική | el |
| dc.contributor.author | Karra, Athina-Vasiliki | en |
| dc.date.accessioned | 2023-10-13T12:02:23Z | - |
| dc.date.available | 2023-10-13T12:02:23Z | - |
| dc.identifier.uri | https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/33114 | - |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.26268/heal.uoi.12885 | - |
| dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States | * |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | * |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/us/ | * |
| dc.subject | MYC/MAX | en |
| dc.subject | Small molecule inhibitors | en |
| dc.subject | In vitro assay | en |
| dc.title | Σάρωση χημικών μορίων με χρήση in vitro δοκιμασίας, για την εύρεση αναστολέων των ογκογονιδίων MYC-MAX | el |
| dc.title | In vitro screening of chemical molecules for the detection of inhibitors of MYC-MAX oncogenes | en |
| dc.type | masterThesis | en |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/masterThesis | * |
| heal.type | masterThesis | el |
| heal.type.en | Master thesis | en |
| heal.type.el | Μεταπτυχιακή εργασία | el |
| heal.classification | Καρκίνος | el |
| heal.classification | Ογκογονίδια | el |
| heal.classification | Cancer | en |
| heal.classification | Oncogenes | en |
| heal.dateAvailable | 2023-10-13T12:03:23Z | - |
| heal.language | el | el |
| heal.access | free | el |
| heal.recordProvider | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών | el |
| heal.publicationDate | 2023-09 | - |
| heal.abstract | Ο καρκίνος είναι μια ασθένεια που χαρακτηρίζεται από την ανεξέλεγκτη ανάπτυξη και διάδοση κακοηθών κυττάρων στο σώμα. Οι κακοήθεις όγκοι αναπτύσσονται όταν τα κύτταρα χάνουν την ικανότητά τους να ελέγχουν την αναπαραγωγή τους και αρχίζουν να διαιρούνται εκθετικά, δημιουργώντας μια μάζα κυττάρων που εξαπλώνεται στο περιβάλλον τους. Οι δύο βασικές κατηγορίες γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο είναι τα ογκογονίδια (oncogenes) και τα ογκοκατασταλτικά γονίδια (tumor suppressor genes). Οι γενετικές αλλαγές που οδηγούν ένα κύτταρο σε καρκινογένεση σχετίζονται με τη μείωση της έκφρασης ή της λειτουργικότητας των ογκοκατασταλτικών γονιδίων και την υπερέκφραση ή την αύξηση της λειτουργικότητας των πρωτο-ογκογονιδίων, που μετατρέπονται σε ογκογονίδια. Το C-Myc/ (ή C-MYC ή MYC) είναι ένα από τα πιο σημαντικά ογκογονίδια που έχουν ανακαλυφθεί. Αυτό το γονίδιο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη- μεταγραφικό παράγοντα MYC που ελέγχει την έκφραση άλλων γονιδίων. Όταν η πρωτεΐνη του MYC σχηματίσει ένα ετεροδιμερές με τον παράγοντα MAX, τότε ενεργοποιείται το μεταγραφικό σύμπλοκο, το οποίο όταν συνδεθεί σε συγκεκριμένες περιοχές του DNA, ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε πλήθος κυτταρικών διεργασιών, γεγονός που μπορεί να επάγει την καρκινογένεση. Η ανακάλυψή του και η αυξημένη συχνότητα με την οποία υπερεκφράζεται, σε πολλούς τύπους καρκίνου το έχουν καταστήσει αντικείμενο έντονης ερευνητικής μελέτης τα τελευταία 40 χρόνια. Στη βιβλιογραφία έχουν περιγραφεί πολλές φαρμακευτικές προσεγγίσεις, μεταξύ των οποίων η σύνθεση μικρών χημικών μορίων που προσδένονται σε επίπεδο πρωτεΐνης στην MYC, αναστέλλοντας τη λειτουργικότητά της. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας είναι η βελτιστοποίηση της μεθόδου χρωματογραφίας συγγένειας που έχει εγκαθιδρυθεί από προηγούμενα μέλη του εργαστηρίου για το έλεγχο της ανασταλτικής δράσης χημικών μορίων έναντι του σχηματισμού του συμπλόκου MYC/MAX. Για την υλοποίηση της δοκιμασίας, παράχθηκαν και απομονώθηκαν οι πρωτεΐνες MYC και MAX από βακτηριακές καλλιέργειες E. coli, σε ανασυνδυασμένη μορφή, έπειτα από προσθήκη κατάλληλων μοριακών ετικετών (GST για την MYC και 6-His για την ΜΑΧ). Η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών μελετήθηκε μέσω της τεχνικής Pull-Down με ακινητοποίηση της GST-MYC σε σφαιρίδια γλουταθειόνης, ενώ η εξακρίβωση του σχηματισμού του συμπλόκου έγινε μετά την ανοσοαποτύπωση των εκλουσμάτων κατά Western. Για τον έλεγχο της μεθόδου ήταν απαραίτητη η χρήση θετικών και αρνητικών μαρτύρων (controls). Ειδικότερα, ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιούνται σφαιρίδια απουσία GST-MYC, για τον έλεγχο της μη ειδικής δέσμευσης της His-MAX (θόρυβος μεθόδου), ενώ ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιούνται μειούμενες ποσότητες GST-MYC σε σφαιρίδια γλουταθειόνης. Μετά από δοκιμασίες βελτιστοποίησης των ποσοτήτων των πρωτεϊνών, που χρησιμοποιούνται, καταλήξαμε στην ιδανική αναλογία mol GST-MYC/His-MAX=1/500. Έπειτα, το πρωτόκολλο εφαρμόστηκε για την ταυτοποίηση νέων αναστολέων σχηματισμού του συμπλόκου MYC-MAX. Από τα πειράματα αυτά προέκυψαν αρκετοί νέοι αναστολείς της MYC όπως οι χημικές ενώσεις Myci23s,GZS11,Myci59, Myci63 N-303-4, Smyc-18, PA-04, C44, BS-45, AS-86, MM-5-1, PA-39, EMA-30, B-55, N-191 οι οποίες προκαλούν σχεδόν πλήρη αναστολή σχηματισμού του συμπλόκου. Τα αποτελέσματα προτείνουν πως η μέθοδος του Pull-Down είναι αξιόπιστη, ευαίσθητη και ειδική και μπορεί να χρησιμοποιηθεί με ασφάλεια για τον πρωταρχικό εντοπισμό αναστολέων της MYC. Ακόμη, στα πλαίσια της βελτιστοποίησης της μεθόδου σάρωσης χημικών μορίων για το σύμπλοκο MYC/MAX, επιδιώχθηκε η εγκαθίδρυση ενός νέου πρωτοκόλλου για τον ίδιο σκοπό με τη μέθοδο ELISA, ώστε να καταστεί ακόμα πιο αποτελεσματική, γρήγορη και ακριβής η σάρωση αυτή. Στην προσπάθεια αυτή, χρησιμοποιήθηκαν πιάτα 96- φρεατίων επικαλυμμένα με γλουταθειόνη, με σκοπό την ακινητοποίηση της GST-MYC και προσθήκη His-MAX για τον σχηματισμό του συμπλόκου. Τα πειράματα που έγιναν κατά τη διάρκεια της μεταπτυχιακής διατριβής κατέδειξαν πως η ιδανική αναλογία mol των πρωτεϊνών είναι GST-MYC/His-MAX = 3/100. Η εγκυρότητα της μεθόδου πιστοποιήθηκε με την δοκιμασία και την ποσοτικοποίηση της ανασταλτικής δράσης ενός γνωστού αναστολέα της MYC, του GSZS11, που, σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές, προκαλεί πλήρη αναστολή του συμπλόκου. Αυτή η νέα μεθοδολογία αναμένεται να επιτρέψει την ταχύτερη σάρωση βιβλιοθηκών χημικών μορίων για την εύρεση νέων αναστολέων της MYC, με υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία. | el |
| heal.abstract | Cancer is a disease characterised by the uncontrolled growth and spread of malignant cells in the body. Malignant tumours develop when cells lose their ability to control their reproduction and begin to divide exponentially, creating a mass of cells that spreads into their environment. The two main categories of genes associated with cancer are oncogenes and tumour suppressor genes. The genetic changes that lead a cell to become carcinogenic are associated with a decrease in the expression or functionality of tumour suppressor genes and an overexpression or increase in the functionality of proto-oncogenes, which are converted into oncogenes. C-Myc/ (or C-MYC or MYC) is one of the most important oncogenes discovered. This gene encodes the protein transcription factor MYC that controls the expression of other genes. When the MYC protein forms a heterodimer with the MAX factor, it activates the transcription complex, which when bound to specific regions of DNA, activates the expression of genes involved in a multitude of cellular processes, which can induce carcinogenesis. Its discovery and the increased frequency with which it is overexpressed in many types of cancer have made it the subject of intense research over the last 40 years. Many pharmaceutical approaches have been described in the literature, including the synthesis of small chemical molecules that bind at the protein level of MYC, inhibiting its functionality. The aim of the present study is to optimize the affinity chromatography method established by previous members of the laboratory to test the inhibitory activity of chemical molecules against the formation of the MYC/MAX complex. To perform the assay, MYC and MAX proteins were produced and isolated from bacterial E.coli cultures, in recombinant form, after addition of appropriate molecular tags (GST for MYC and 6-His for MAX). The interaction of the proteins was studied by the Pull-down technique by immobilizing GST-MYC on glutathione beads, while the verification of the complex formation was performed after Western immunoprecipitation of the eluates. To test the method, the use of positive and negative controls was necessary. In particular, beads in the absence of GST-MYC were used as negative controls to check for non-specific binding of His-MAX (method noise), while decreasing amounts of GST-MYC in glutathione beads were used as positive controls. After tests to optimize the amounts of proteins used, we arrived at the ideal GST-MYC/His-MAX mol ratio = 1/500. Then, the protocol was applied to identify new inhibitors of MYC-MAX complex formation. These experiments resulted in several new MYC inhibitors such as the chemical compounds Myci23s, GZS11, Myci59, Myci63 N-303-4, Smyc-18, PA-04, C44, BS-45, AS-86, MM-5-1, PA-39, EMA-30, B-55, N-191 which cause almost complete inhibition of complex formation. The results suggest that the Pull-down method is reliable, sensitive and specific and can be safely used for the primary identification of MYC inhibitors. Furthermore, in the context of the optimization of the chemical molecule screening method for the MYC/MAX complex, a new protocol was established for the same purpose using the ELISA technique, in order to make this scan even more efficient, fast and accurate. In this effort, 96-well plates coated with glutathione were used to immobilize GST-MYC and add His-MAX to form the complex. Experiments performed during the master thesis demonstrated that the ideal mole ratio of the proteins is GST-MYC/His-MAX = 3/100. Confirmation of the reliability of the method was validated by testing and quantifying the inhibitory effect of a known inhibitor of MYC, GSZS11, which, according to previous reports, causes complete inhibition of the complex. This new methodology is expected to allow faster screening of chemical molecule libraries in search of novel MYC inhibitors with high specificity and sensitivity. | en |
| heal.advisorName | Χριστοφορίδης, Σάββας | el |
| heal.committeeMemberName | Μιχαηλίδης, Θεολόγο | el |
| heal.committeeMemberName | Τράγκα, Θεώνη | el |
| heal.committeeMemberName | Χριστοφορίδης, Σάββας | el |
| heal.academicPublisher | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Χημείας | el |
| heal.academicPublisherID | uoi | el |
| heal.numberOfPages | 117 σ. | el |
| heal.fullTextAvailability | true | - |
| Appears in Collections: | Διατριβές Μεταπτυχιακής Έρευνας (Masters) - ΧΗΜ | |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Διπλωματική Εργασία- ΚΑΡΡΑ ΑΘΗΝΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ.pdf | 2.88 MB | Adobe PDF | View/Open |
This item is licensed under a Creative Commons License
