Spatiotemporal coordination and mechanisms of communication between endocytosis and regulated exocytosis upon VEGFR2 signaling in endothelial cells (Doctoral thesis)

Γούλα, Ευαγγελή


So far, endocytosis induced signaling as well as signaling induced exocytosis have been studied separately. Thus, it remains unknown whether endocytosis and exocytosis are interdependent processes and which are the basic molecular mechanisms of this relationship? In the present study, the inhibitors dyngo-4a (for clathrin-dependent endocytosis) and EIPA (for macropinocytosis) were used to block the different internalization routes of VEGFR2 and the consequences of this inhibition on WPBs exocytosis were tested. The results demonstrate that clathrin-dependent endocytosis of VEGFR2 causes a minor inhibition on the percentage of secreted vWF, as compared to macropinocytosis, which has the predominant inhibitory role. The inhibitory role of macropinocytosis on VEGF-induced WPBs exocytosis was also tested by siRNAs treatments of common regulatory proteins of the macropinocytosis route (Rabankyrin-5, CDC42), followed by assessment of the secreted vWF by an ELISA-based method. Indeed, siRNAs treatment of the above proteins, individually or in combination, increased the VEGF-induced WPBs exocytosis. In addition, time-lapse confocal video microscopy in HUVECs suggests that upon VEGF stimulation, VEGFR2 positive endosomes are in limited contact with WPBs. In order to better understanding of the molecular mechanisms responsible for VEGF-induced exocytosis of WPBs, we employed a proteomic analysis of the secreted proteins in activated endothelial cells. Among the secreted proteins which were analyzed by high resolution mass spectrometry (nLC-MS/MS) was the galectin-1 protein (Gal-1). In the present study we found that galectin-1 is targeted to the WPBs of endothelial cells, since confocal microscopy (LSCM/CLSM) with/or STED demonstrates that galectin-1 co-localizes with vWF, the main cargo molecule of WPBs. This observation was also confirmed by its co-localization with other bona fide markers of WPBs (P-selectin, Rab27a, Rab3a, Rab3d). Surprisingly, galectin-1 was found only in a subset of WPBs and in a “rare” subpopulation of HUVECs. The results show that, upon VEGF/bFGF/ATP induction galectin-1 is localized in WPBs that recapture the extracellular anti-vWF antibodies, thus undergo "kiss-and-run" exocytosis. In parallel, internalization assays of recombinant galectin-1 proteins added extracellularly in culture medium, in control and siRNA treated for galectin-1 HUVECs, show that recombinant galectin-1 is localized in a limited number of WPBs. In addition, removal of extracellular galectin-1 from the culture medium reduces the number of galectin-1 positive WPBs significantly. The above data provide novel insights into the mechanism of unconventional secretion of galectin-1, implying that its secretion is partly, due to “kiss-and-run” exocytosis of WPBs.
Institution and School/Department of submitter: Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Subject classification: Κύτταρα
Keywords: Ενδοκυττάρωση,Μακροπινοκυττάρωση,Σηματοδότηση του VEGFR2,UPS (Μη συμβατική πρωτεϊνική έκκριση),Ενδοθηλιακά κύτταρα,Endocytosis,Macropinocytosis,VEGFR2 signaling
URI: http://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/29464
Item type: doctoralThesis
Subject classification: Κύτταρα
Submission Date: 2019-07-26T10:39:24Z
Item access scheme: free
Institution and School/Department of submitter: Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Publication date: 2019
Bibliographic citation: Βιβλιογραφία: σ. 153-175
Abstract: Μέχρι στιγμής, η επαγόμενη από την ενδοκυττάρωση σηματοδότηση καθώς και η σηματοδοτούμενη εξωκυττάρωση έχουν μελετηθεί ξεχωριστά. Έτσι, δεν γνωρίζουμε αν η ενδοκυττάρωση και η εξωκυττάρωση είναι αλληλοεξαρτώμενες διαδικασίες και ποιοι είναι οι βασικοί μοριακοί μηχανισμοί αυτής της σχέσης. Στην παρούσα μελέτη, οι χημικοί αναστολείς dyngo-4a (για το εξαρτώμενο από την κλαθρίνη μονοπάτι ενδοκυττάρωσης) και ΕΙΡΑ (για την μακροπινοκυττάρωση) χρησιμοποιήθηκαν για την αναστολή των διαφορετικών ενδοκυτταρικών οδών του VEGFR2 και μελετήθηκε η επίδραση αυτής της αναστολής στην εξωκυττάρωση των WPBs. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το εξαρτώμενο από κλαθρίνη μονοπάτι ενδοκυττάρωσης του VEGFR2 έχει μικρή ανασταλτική δράση στο ποσοστό του εκκρινόμενου vWF, σε αντίθεση με την μακροπινοκυττάρωση, η οποία φαίνεται να έχει σημαντικό ανασταλτικό ρόλο. Ο ανασταλτικός ρόλος της μακροπινοκυττάρωσης στην VEGF επαγόμενη εξωκυττάρωση των WPBs ελέγχθηκε και με πειράματα αποσιώπησης πρωτεϊνών-τελεστών της μακροπινοκυττάρωσης (Rabankyrin-5, CDC42), με χρήση siRNAs και ακόλουθη μέτρηση του εκκρινόμενου vWF με δοκιμασία ELISA. Πράγματι, η αποσιώπηση των δύο αυτών πρωτεϊνών, ξεχωριστά ή συνδυαστικά, οδήγησε σε αύξηση της επαγόμενης εξωκυττάρωσης των WPBs. Επιπλέον, συνεστιακή μικροσκοπία πραγματικού χρόνου σε ζωντανά κύτταρα HUVE υποδεικνύει ότι μετά από ενεργοποίηση με VEGF, ο εντοπισμένος σε ενδοσωματικά κυστίδια VEGFR2 βρίσκεται σε περιορισμένες επαφές με τα WPBs. Για να κατανοήσουμε καλύτερα τους μοριακούς μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την μεταγωγή του σήματος του VEGF και σχετίζονται με την εξωκυττάρωση των WPBs, πραγματοποιήθηκε πρωτεομική ανάλυση των εκκρινόμενων πρωτεϊνών σε ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μεταξύ των εκκρινόμενων πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (nLC-MS/MS) συμπεριλαμβάνεται και η πρωτεΐνη galectin-1 (Gal-1). Στην παρούσα μελέτη βρήκαμε ότι η galectin-1 εντοπίζεται στα WPBs των ενδοθηλιακών κυττάρων, αφού συνεστιακή μικροσκοπία (LSCM/CLSM) με ή χωρίς την χρήση υπερδιακριτικής ικανότητας (STED) απέδειξε τον πλήρη συνεντοπισμό της galectin-1 με τον vWF, το κύριο πρωτεϊνικό φορτίο των WPBs. Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώθηκε από τον συνεντοπισμό της και με άλλες γνωστές πρωτεΐνες-δείκτες των WPBs (P-selectin, Rab27a, Rab3a, Rab3d). Προς έκπληξή μας, η galectin-1 βρέθηκε να εντοπίζεται σε ένα υποσύνολο των WPBs και σε ένα περιορισμένο αριθμό κυττάρων HUVE. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, μετά από ενεργοποίηση της έκκρισης με VEGF/bFGF/ATP η galectin-1 εντοπίζεται στα WPBs που προσέλαβαν τα αντισώματα έναντι του vWF, και επομένως υπέστησαν “kiss-and-run” εξωκυττάρωση. Παράλληλα, πειράματα πρόσληψης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών galectin-1 που προστέθηκαν εξωγενώς στο θρεπτικό καλλιέργειας, σε φυσιολογικά αλλά και σε κύτταρα όπου η ενδογενής galectin-1 αποσιωποιήθηκε με siRNAs, έδειξαν την παρουσία της ανασυνδυασμένης galectin-1 σε περιορισμένο αριθμό WPBs. Επιπλέον, η απομάκρυνση της εξωκυττάριας galectin-1 από το θρεπτικό καλλιέργειας των κυττάρων μείωσε αισθητά τον αριθμό των θετικών για την galectin-1 WPBs. Τα παραπάνω δεδομένα παρέχουν νέες πληροφορίες για τον μηχανισμό της μη συμβατικής έκκρισης της galectin-1, υποδηλώνοντας ότι η έκκρισή της, εν μέρει, οφείλεται στην “kiss-and-run” εξωκυττάρωση των WPBs.
So far, endocytosis induced signaling as well as signaling induced exocytosis have been studied separately. Thus, it remains unknown whether endocytosis and exocytosis are interdependent processes and which are the basic molecular mechanisms of this relationship? In the present study, the inhibitors dyngo-4a (for clathrin-dependent endocytosis) and EIPA (for macropinocytosis) were used to block the different internalization routes of VEGFR2 and the consequences of this inhibition on WPBs exocytosis were tested. The results demonstrate that clathrin-dependent endocytosis of VEGFR2 causes a minor inhibition on the percentage of secreted vWF, as compared to macropinocytosis, which has the predominant inhibitory role. The inhibitory role of macropinocytosis on VEGF-induced WPBs exocytosis was also tested by siRNAs treatments of common regulatory proteins of the macropinocytosis route (Rabankyrin-5, CDC42), followed by assessment of the secreted vWF by an ELISA-based method. Indeed, siRNAs treatment of the above proteins, individually or in combination, increased the VEGF-induced WPBs exocytosis. In addition, time-lapse confocal video microscopy in HUVECs suggests that upon VEGF stimulation, VEGFR2 positive endosomes are in limited contact with WPBs. In order to better understanding of the molecular mechanisms responsible for VEGF-induced exocytosis of WPBs, we employed a proteomic analysis of the secreted proteins in activated endothelial cells. Among the secreted proteins which were analyzed by high resolution mass spectrometry (nLC-MS/MS) was the galectin-1 protein (Gal-1). In the present study we found that galectin-1 is targeted to the WPBs of endothelial cells, since confocal microscopy (LSCM/CLSM) with/or STED demonstrates that galectin-1 co-localizes with vWF, the main cargo molecule of WPBs. This observation was also confirmed by its co-localization with other bona fide markers of WPBs (P-selectin, Rab27a, Rab3a, Rab3d). Surprisingly, galectin-1 was found only in a subset of WPBs and in a “rare” subpopulation of HUVECs. The results show that, upon VEGF/bFGF/ATP induction galectin-1 is localized in WPBs that recapture the extracellular anti-vWF antibodies, thus undergo "kiss-and-run" exocytosis. In parallel, internalization assays of recombinant galectin-1 proteins added extracellularly in culture medium, in control and siRNA treated for galectin-1 HUVECs, show that recombinant galectin-1 is localized in a limited number of WPBs. In addition, removal of extracellular galectin-1 from the culture medium reduces the number of galectin-1 positive WPBs significantly. The above data provide novel insights into the mechanism of unconventional secretion of galectin-1, implying that its secretion is partly, due to “kiss-and-run” exocytosis of WPBs.
Advisor name: Χριστοφορίδης, Σάββας
Examining committee: Χριστοφορίδης, Σάββας
Φώτσης, Θεόδωρος
Μιχαηλίδης, Θεολόγος
Κούκλης, Παναγιώτης
Λεονταρίτης, Γεώργιος
Murphy, Carol
Fachelmayer, Frank
Publishing department/division: Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Publishing institution: uoi
Number of pages: 175 σ.
Appears in Collections:Διδακτορικές Διατριβές

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Δ.Δ. ΓΟΥΛΑ ΕΥΑΓΓΕΛΗ 2019.pdf9.79 MBAdobe PDFView/Open    Request a copy



 Please use this identifier to cite or link to this item:
http://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/29464
  This item is a favorite for 0 people.

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.