The role of intracellular labile iron in redox signal transductions (Doctoral thesis)

Ρουπάκα, Βασιλική


Iron (Fe) is an essential element for a variety of important biological processes. The ability of iron to exist in various oxidation states makes it an essential element in many cellular processes associated with basic physiological cell functions. On the other hand, the same high redox potential that enables iron to readily switch between the ferrous and ferric states also makes it potentially toxic. Although, iron is usually bound with high affinity to specialized proteins in order to abrogate the deleterious effects of free iron during oxidative stress, a distinct minor fraction of total cellular iron is thought to be loosely bound to diverse intracellular ligants and serves as a crossroad of cell iron metabolism. This fraction of iron is called redox-active iron and in the presence of H2O2, it catalyzes the generation of the extremely reactive hydroxyl radical (HO·), which rapidly react and oxidize the cellular components. Recent studies of our research group have shown that redox active iron appears to be essential for the signal transduction. Redox active iron is specifically responsible for the sustained activation of the MAP kinase JNK/p38 axis, which is critical for apoptotic cell death. In this study, we further investigated the role of redox active iron in H2O2 induced signaling. Furthermore, we investigated the role of Trxl and Grxl on the phosphorylation of the three MAP kinases (JNK, p38, ERK) phosphorylation under oxidative stress conditions. For this purpose, we preincubated HI299 cell line (human pulmonary cancer cells) with a specific iron chelator desferioxamine (DFO) and then challenged with H2O2. DFO represents a strong iron chelator, which is taken up by fluid phase endocytosis, reaching the lysosomal compartment. Iron depletion by DFO attenuated the second prolonged phases of JNK and p38, but had slight effect on ERK phosphorylation, which is regulated cell survival and proliferation. Next we tested the role of Trxl and Grxl, which involved in maintenance of intracellular redox homeostasis, on MAP kinases phosphorylation. For this purpose, Trxl and Grxl were stably overexpressed or silenced in the same HI299 cell line. Upon H2O2 treatment, overexpression of Trxl reduced the sustained phosphorylation of JNK and the two phosphorylation phases of p38. On the other hand, overexpression of Grxl reduced the sustained phosphorylation of JNK and mainly the sustained phosporylation of p38. In addition, downregulation of Trxl promoted the sustained phosphorylation of JNK and the two phosphorylation phases of p38 upon H2O2 challenge. On the contrary, downregulation of Grxl increased mainly the prolonged phases of JNK and p38 phosphorylation. Interestingly, overexpression/silencing of Trxl and Grxl respectively, had no effect on ERK phosphorylation. The phosphorylation levels of MAP kinases depend on upstream kinases MAPKK and MAPKKK. It is proposed that ASK1, a special MAPKKK, is responsible for the phosphorylation of JNK and p38. After cell exposure to H2O2, it was observed two phases of disulfide bond formation of this kinase. The oxidation of cysteine residues in ASK1 resulting at the formation of disulfide bonds among ASK1 molecules or other proteins. Afterwards, the role of labile iron in H2O2- induced oxidation of ASK1 was investigated. Interestingly, the second phase of ASK1 oxidation was attenuated by DFO, implicating labile iron in ASK1 oxidation.In conclusion intracellular labile iron, Trxl and Grxl have a more specific role in H2O2 induced apoptosis. However, the precise role of these molecules has to be elucidated.
Institution and School/Department of submitter: Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Subject classification: Σίδηρος
Keywords: Καταλυτικά ενεργός σίδηρος,Δεσφεριοξαμίνη,Υπεροξείδιο του υδρογόνου,Απόπτωση,Θειορεδοξίνη 1,Γλουταρεδοξίνη 1,Labile Iron Pool (LIP),Desferrioxamine,Hydrogen peroxide,Apoptosis,Thioredoxin 1,Glutaredoxin 1
URI: http://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/29244
Item type: doctoralThesis
Subject classification: Σίδηρος
Submission Date: 2019-01-21T10:51:59Z
Item language: el
Item access scheme: free
Institution and School/Department of submitter: Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Publication date: 2018
Bibliographic citation: Βιβλιογραφία: σ. 104-117
Abstract: Ο σίδηρος (Fe) αποτελεί ένα σημαντικό στοιχείο καθώς εμπλέκεται σε μεγάλο αριθμό κυτταρικών λειτουργιών. Η ιδιότητα των ιόντων σιδήρου να μεταβάλλουν την οξειδοαναγωγική τους κατάσταση τους προσδίδει αφενός μία προνομιακή θέση στη ζώσα ύλη, αφετέρου τα καθιστά πιθανές πηγές κινδύνου. Εντούτοις, στο κυτταρόπλασμα υπάρχει μια μικρή ποσότητα σιδήρου που είναι δεσμευμένη με μικρή συγγένεια σε διάφορα ενδοκυττάρια μόρια και είναι άμεσα διαθέσιμη στο κύτταρο για την κάλυψη των αναγκών του. Το μέρος αυτό του σιδήρου καλείται «οξειδοαναγωγικά ενεργός σίδηρος» (Labile Iron Pool, LIP), καθώς είναι ικανό να αντιδρά με Η2Ο2, με συνέπεια τη δημιουργία των εξαιρετικά δραστικών ριζών υδροξυλίου (ΌΗ), οι οποίες όταν σχηματισθούν αντιδρούν ακαριαία, οξειδώνοντας τα κυτταρικά συστατικά. Πρόσφατες μελέτες της εργαστηριακής μας ομάδας, έδειξαν ότι τα καταλυτικά ενεργά ιόντα σιδήρου εμπλέκονται στην κυτταρική σηματοδότηση. Πιο συγκεκριμένα, εμπλέκονται στην παρατεταμένη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των MAP κινασών, JNK και ρ38 η οποία σχετίζεται με τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Στην παρούσα εργασία, διερευνήθηκε διεξοδικά ο ρόλος των ιόντων σιδήρου και των πρωτεϊνών θειορεδοξίνη 1 (Trxl) και γλουταρεδοξίνη 1 (Trxl) στην επαγωγή της απόπτωσης από το Η2Ο2. Η δέσμευση του ενδοκυττάριου σιδήρου έγινε με τη χρήση της ισχυρής σιδηροδεσμευτικής ένωσης δεσφεριοξαμίνης (DFO) η οποία εισέρχεται στα κύτταρα με ενδοκύττωση υγρής φάσης και μέσω των ενδοσωματίων καταλήγει στα λυσοσωμάτια. Για την εκτέλεση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά Η1299 (ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα). Διαπιστώθηκε ότι η δέσμευση των ιόντων σιδήρου ανέστειλε την παρατεταμένη φωσφορυλίωση των JNK και ρ38 που προκαλείται μετά από την έκθεση των κυττάρων σε οξειδωτικό στρες υπό τη μορφή του Η2Ο2. Αντιθέτως, δεν επηρέασε ή επηρέασε σε μικρό βαθμό τη φωσφορυλίωση της ERK, μιας κινάσης η οποία ρυθμίζει άλλες κυτταρικές διεργασίες, όπως η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός. Στο επόμενο στάδιο της παρούσας εργασίας, ελέγχθηκαν οι επιπτώσεις της Trxl και της Grxl, δυο βασικών ρυθμιστών της οξειδοαναγωγικής ισσοροπίας των κυττάρων στην ενεργοποίηση των MAP κινασών. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκαν 4 διαφορετικές σταθερές κυτταρικές σειρές Η1299, οι οποίες είτε υπερεκφράζουν είτε υποεκφράζουν κάθε μια από τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Όταν οι σειρές αυτές εκτέθηκαν σε Η2Ο2 παρατηρήθηκε ότι η υπερέκφραση της Trxl, ανέστειλε τη φωσφορυλίωση τόσο της JNK όσο και των δύο φάσεων της ρ38. Αντίθετα, διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση της Grxl ανέστειλε τη φωσφορυλίωση της JNK αλλά μόνο τη δεύτερη φάση φωσφορυλίωσης της ρ38, χωρίς να επηρεάζει την πρώτη φάση. Ωστόσο, η υπερέκφραση των Trxl και Grxl δεν επηρέασε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Από την άλλη πλευρά η υποέκφραση και των δύο αυτών πρωτεϊνών προκάλεσε την αυξημένη φωσφορυλίωση της JNK μετά από έκθεση των κυττάρων σε Η2Ο2. Όσον αφορά την ρ38, η υποέκφραση της Trxl ενίσχυε και τις δύο φάσεις φωσφορυλίωσής της, σε αντίθεση με την Grxl που ενίσχυε μόνο τη δεύτερη, αλλά όχι την πρώτη. Τέλος, η αποσιώπηση των εν λόγω πρωτεϊνών δεν επηρέασε την επαγωγή της φωσφορυλίωσης της ERK. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των MAP κινασών εξαρτώνται από ανοδικές κινάσες, τις ΜΑΡΚΚ και αυτές με τη σειρά τους από τις ΜΑΡΚΚΚ. Υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση των JNK και ρ38 έχει προταθεί ότι είναι μια ειδική ΜΑΡΚΚΚ, η ASK1. Μετά από έκθεση των κυττάρων σε Η2Ο2 παρατηρήθηκαν δύο φάσεις σχηματισμού δισουλφιδικών δεσμών της εν λόγω κινάσης. Κυστεϊνικά κατάλοιπα στην ASK1 οξειδώνονται δημιουργώντας δισουλφιδικό(ούς) δεσμό(ούς) είτε με ένα άλλο μόριο ASK1 (διμερή) είτε με άλλες πρωτεΐνες. Εν συνεχεία ελέγχθηκε ο ρόλος των ιόντων σιδήρου στην οξείδωση της ASK1. Διαπιστώθηκε ότι η δέσμευση των ιόντων σιδήρου ανέστειλε κυρίως τη δεύτερη φάση οξείδωσης της ASK1. Συμπερασματικά, από την παρούσα εργασία, προκύπτει ότι τα ιόντα σιδήρου καθώς και οι πρωτεΐνες Trxl και Grxl, έχουν εξειδικευμένους ρόλους και εμπλέκονται στη διαδικασία της απόπτωσης που προκαλείται σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Ωστόσο, ο ακριβής προσδιορισμός του μοριακού μηχανισμού χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.
Iron (Fe) is an essential element for a variety of important biological processes. The ability of iron to exist in various oxidation states makes it an essential element in many cellular processes associated with basic physiological cell functions. On the other hand, the same high redox potential that enables iron to readily switch between the ferrous and ferric states also makes it potentially toxic. Although, iron is usually bound with high affinity to specialized proteins in order to abrogate the deleterious effects of free iron during oxidative stress, a distinct minor fraction of total cellular iron is thought to be loosely bound to diverse intracellular ligants and serves as a crossroad of cell iron metabolism. This fraction of iron is called redox-active iron and in the presence of H2O2, it catalyzes the generation of the extremely reactive hydroxyl radical (HO·), which rapidly react and oxidize the cellular components. Recent studies of our research group have shown that redox active iron appears to be essential for the signal transduction. Redox active iron is specifically responsible for the sustained activation of the MAP kinase JNK/p38 axis, which is critical for apoptotic cell death. In this study, we further investigated the role of redox active iron in H2O2 induced signaling. Furthermore, we investigated the role of Trxl and Grxl on the phosphorylation of the three MAP kinases (JNK, p38, ERK) phosphorylation under oxidative stress conditions. For this purpose, we preincubated HI299 cell line (human pulmonary cancer cells) with a specific iron chelator desferioxamine (DFO) and then challenged with H2O2. DFO represents a strong iron chelator, which is taken up by fluid phase endocytosis, reaching the lysosomal compartment. Iron depletion by DFO attenuated the second prolonged phases of JNK and p38, but had slight effect on ERK phosphorylation, which is regulated cell survival and proliferation. Next we tested the role of Trxl and Grxl, which involved in maintenance of intracellular redox homeostasis, on MAP kinases phosphorylation. For this purpose, Trxl and Grxl were stably overexpressed or silenced in the same HI299 cell line. Upon H2O2 treatment, overexpression of Trxl reduced the sustained phosphorylation of JNK and the two phosphorylation phases of p38. On the other hand, overexpression of Grxl reduced the sustained phosphorylation of JNK and mainly the sustained phosporylation of p38. In addition, downregulation of Trxl promoted the sustained phosphorylation of JNK and the two phosphorylation phases of p38 upon H2O2 challenge. On the contrary, downregulation of Grxl increased mainly the prolonged phases of JNK and p38 phosphorylation. Interestingly, overexpression/silencing of Trxl and Grxl respectively, had no effect on ERK phosphorylation. The phosphorylation levels of MAP kinases depend on upstream kinases MAPKK and MAPKKK. It is proposed that ASK1, a special MAPKKK, is responsible for the phosphorylation of JNK and p38. After cell exposure to H2O2, it was observed two phases of disulfide bond formation of this kinase. The oxidation of cysteine residues in ASK1 resulting at the formation of disulfide bonds among ASK1 molecules or other proteins. Afterwards, the role of labile iron in H2O2- induced oxidation of ASK1 was investigated. Interestingly, the second phase of ASK1 oxidation was attenuated by DFO, implicating labile iron in ASK1 oxidation.In conclusion intracellular labile iron, Trxl and Grxl have a more specific role in H2O2 induced apoptosis. However, the precise role of these molecules has to be elucidated.
Advisor name: Γαλάρης, Δημήτριος
Examining committee: Γαλάρης, Δημήτριος
Κωνσταντή, Μαρία
Φώτσης, Θεόδωρος
Μιχαηλίδης, Θεολόγος
Χριστοφορίδης, Σάββας
Κούκλης, Παναγιώτης
Μπαρμπούνη, Αλεξάνδρα
Publishing department/division: Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Publishing institution: uoi
Number of pages: 117 σ.
Appears in Collections:Διδακτορικές Διατριβές

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Δ.Δ. ΡΟΥΠΑΚΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ 2018.pdf4.77 MBAdobe PDFView/Open    Request a copy



 Please use this identifier to cite or link to this item:
http://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/29244
  This item is a favorite for 0 people.

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.